大肠癌转移相关基因骨桥蛋白反义及正义真核表达质粒的构建
【摘要】 目的 构建大肠癌转移相关基因骨桥蛋白(OPN)反义和正义真核表达质粒。方法 运用PT-PCR技术分别克隆两种OPN cDNA序列:pGEM-T Easy-OPN(反义201bp)和pGEM-T Easy-OPN(ORF)，并由此构建两种重组真核表达质粒:pcDNA3.1(+)-OPN(201bp)反义真核表达质粒和pcDNA3.1(+)-OPN(ORF)正义真核表达质粒。结果 OPN反义和正义真核表达质粒构建成功。结论 两种真核表达质粒的构建成功，为进一步研究OPN与大肠癌肝转移的相关性提供了实验平台。
关键词 结直肠癌 骨桥蛋白 质粒
Construction of antisense-and sense-osteopontin eukaryotic expression plasmids
Ding Ling，Zheng Shu，Ding Jiayi.
Oncology section，2nd affiliated hospital，Zhejiang University，Hangzhou310009.
【Abstract】 Objective Construction of sense-and antisense-ostepontin ekuaryotic expression plamids.Methˉods Using RT-PCR method，pGEM-T Easy-OPN(antisense201bp)and pGEM-T Easy-OPN(ORF)were cloned.pcDNA3.1(+)-OPN(antisense201bp)and pcDNA3.1(+)-OPN(ORF)eukaryotic expression plasmids were contructed based on them.Results There plasmids were constructed and testified by enzymolysis and sequence scan.Conclusion The eukaryotic expression plamids provide experimental platform for following investigation on OPN and metastasis in colorectal carcinoma.
Key words colorectal neoplasm osteopontin plasmid
骨桥蛋白(osteopontin，OPN)基因定位在人类基因组的4q13和大鼠第5个染色本的ric基因上。人OPN基因cDNA编码区全长为945bp，所编码的骨桥蛋白分子量约为44kD [1] 。笔者前期实验工作中应用RT-PCR和实时荧光定量PCR方法证实:OPN mRNA在大肠癌肝转移组织中表达最高，大肠癌原发组织中次之，而在原发灶旁正常大肠粘膜组织中表达最低 [2] 。为进一步行细胞转染、原位杂交等以研究OPN与大肠癌肝转移的相关功能，笔者运用RT-PCR技术分别克隆两种OPN cDNA序列:pGEM-T Easy-OPN(反义201bp)和pGEM-T Easy-OPN(ORF)，并由此构建两种重组真核表达质粒:pcDˉNA3.1(+)-OPN(201bp)反义真核表达质粒和pcDˉNA3.1(+)-OPN(ORF)正义真核表达质粒。
1 材料
1.1 原核表达载体pGEM-T Easy，T4-DNA连接酶，Alkalin Phosphatase Calf intestinal购自Promega公司。
1.2 真核表达载体pcDNA3.1(+)购自Invitrogen
1.3 PCR产物回收试剂盒，购自QIACEN公司。
1.4 逆转录酶SUPER SCRIPTⅡ，限制性内切酶(Eco R I，Not I，Bam H I，PvuⅡ等)购自GIBCO公司。
1.5 大肠杆菌(E.Coli):DH5α，XL1-Blue由浙江大学肿瘤研究所提供。
2 方法
2.1 OPN cDNA序列克隆
2.1.1 RT-PCR 取术后离体大肠癌肝转移在液氮中研磨成粉，用Trizol法行RNA提取。运用分光光度仪及甲醛变性凝胶电泳检测RNA质量后，取RNA1μg，用SUPER SCRIPTⅡ进行逆转录，所得cDˉNA用于PCR扩增。OPN引物1:上游:5′>CAA ATA CCC AGA TGC TGT GGC<3′，下游5′>5′TCC TGG CTG TCC ACA TGG AC<3′(理论扩增片段201bp);OPN引物2上游:5′>CCG ACC AAG GAA AAC TCA CT<3′下游:5′>CTC CTTTTA ATTGAC CTC AG<3′(ORF:理论扩增片段为974bp)。PCR扩增条件:94℃5min，94℃30s，55℃45s，72℃30s，35个循环，循环结束后72℃延伸7min。紫光下将PCR电泳产物切胶，用PCR产物回收试剂盒QG法回收PCR产物，取适量回收产物行凝胶电泳鉴定。
2.1.2 T-A克隆 PCR产物用T4DNA ligase进行T-A克隆，并将10μl克隆连接产物加入50μl感受态细胞E.Coli)(DH5α)中，进行转化反应。用碱裂解法提取质粒DNA [3] ，干燥后TE溶解。
2.1.3 酶切及测序鉴定 构建之原核表达质粒pGEM-TEasy-OPN(201bp)和pEGM-TEasy-OPN(ORF)分别用EcoR I和Not I37℃水浴酶切过夜。酶切产物经凝胶电泳验证无误后，再将T-A克隆之质粒送测序证实。
2.2 OPN反义真核表达质粒的构建 pGEM-T Easy-OPN(201bp)酶切产物经凝胶电泳在紫外光下切胶，QG回收，并测定浓度。真核表达载体pc DNA3.1(+)用EcoR I酶切成线性结构后，为防止连接反应时自身环化，将之用Alkaline Phosphatase Calf intestinal进行去磷酸化，37℃反应30min，50℃反应30min，75℃反应10min，置冰上结束反应。而后用酚氯仿抽提回收，用70%预冷乙醇洗净后，加TE溶解。再将pGEM-T Easy-OPN(201bp)酶切产物与pc DNA3.1(+)-EcoR I酶切产物用T4DNA ligase连接，构建pcDNA3.1(+)-OPN(反应201bp)真核表达质粒。经E.Coli(DH5α)转化后，质粒提取，经EcoR I酶切及测序鉴定证实。
2.3 OPN正义真核表达质粒的构建 先用Not I将pc DNA3.1(+)切成线性后再用Alkaline Phosphatase Calf intestina去磷酸化，将之与经Not I酶切的pGEM-T Easy-OPN(ORF)行连接反应，构建pcDNA3.1(+)-OPN(ORF)真核表达质粒。经E.Coli(DH5α)转化后，质粒提取。并分析pcDNA3.1(+)-OPN(ORF)质粒酶切位点后，采用PvuⅡ和BamH I双酶切，电泳初步鉴定后经测序证实。
3 结果
3.1 pGEM-T Easy-OPN(反义201bp)酶切结果 见图1。
3.2 pcDNA3.1(+)-OPN(反义201bp)真核表达质粒酶切结果 见图2。
3.3 pGEM-T Easy-OPN(ORF)酶切及测序结果 见图3。
3.4 pcDNA3.1(+)-OPN(ORF)真核表质粒酶切及测序结果 见图4。
4 讨论
OPN是一种富含丝氨酸残基的磷酸化糖蛋白，其中含有特异的Arg-Gly-Asp序列(RGD)，这个序列是蛋白质分子中与细胞粘附有关的重要功能 图1 pGEM-T Easy-OPN(反义201bp)酶切鉴定结果 1-5经EcoR I酶切后均可见约OPN(201bp)酶切片段 图2 pcDNA3.1(+)-OPN(反义201bp)真核表达质粒酶切鉴定结果 1，3为经EcoR I酶切后，见约250酶切片段;2，4为酶切前的质粒 图3 pGEM-T Easy-OPN(ORF)酶切鉴定结果 1，DL2000;2，3，pGEM-T Easy-OPN(ORF)经Not I酶切 域 [4] 。OPN不仅与骨组织的矿化密切相关，而胜在许多非矿化组织中，如血管、内耳、肾、胆囊、胰腺、甚至在巨噬细胞和激活T淋巴细胞等中都发现了该蛋白的表达，还发现它与Ca 2+ 、NO - 等细胞信使、巨噬细胞趋化反应、平滑肌细胞增生及感染等多种生理、病理现象密切相关 [5] 。OPN与骨组织的矿化、泌尿系结石的形成和动脉粥样硬化等生理、病理现象的相关性已得到大量文献证实，而OPN与恶性肿瘤发生发展的关系特别是与肿瘤转移的相关性正日益引起人们的关注 [6] 。但对OPN在大肠癌肝转移中的相关机制研究，国内外尚没有相关报道。图4 pcDNA3.1(+)-ORF正义真核表达质粒酶切鉴定结果 3，4经PvuⅡ和BamHⅠ酶切，酶切片段正确 笔者曾应用RT-PCR和实时荧光定量PCR方法对44例大肠癌配对组织和20例大肠癌肝转移组织的OPN mRNA检测结果证实，OPN mRNA在大肠癌肝转移组织中表达最高，大肠癌原发组织中的次之，而在原发灶旁正常大肠粘膜中表达最低，证实了OPN与大肠癌肝转移的相关性。同时用免疫组化方法也发现OPN蛋白在绝大多数大肠癌细胞浆中表达阳性，癌旁正常粘膜表达阴性，在肝转移灶中大肠癌细胞浆表达阳性 [7] 。提示OPN可能与大肠癌的 肝转移有密切关系。 为制备PNA原位杂交探针以检测OPN mRNA在不同组织中的定位，并为研究OPN转移相关机制的细胞转染作准备，笔者通过本实验运用PT-PCR技术分别克隆了两种OPN cDNA序列:反义序列(201bp)和ORF(974bp)，并由此构建了两种重组真核表达质粒:pcDNA3.1(+)-OPN(201bp)反义真核表达质粒和pcDNA3.1(+)-OPN(ORF)正义真核表达质粒，酶切和测序结果均显示这两种重组质粒构建成功。为下一步研究OPN与大肠癌肝转移的相关机制提供了实验平台。
参考文献
1 Fet V，Dickinson ME，Hogan BL.Localization of the mousegeneforsecretedphosphoprotein1(Spp-1)(2ar，osteopontin，bone sialoprotein1，44-kDa bone phosphoproteintumorsecreted phosphoprotein)to chroˉmosome5，closely linked to Ric(Rickettsia resistance).Genomics，1989，5(2):375-377.
2 丁凌，郑树.骨桥蛋白在大肠癌和大肠癌肝转移中的表达及其临床意义.中华外科杂志，2002，40(10):773-775.
3 J.Sambrook，E.F.Fritsch，T.maniatis.Molecular Cloning，A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989.
4 Chambers AF，Hota C，Prince CW，et al.Adhesion of metastatic，ras-transformed NIH3T3cells to osteopontin，fibronectin，and laminin.Cancer Res，1993，53:701-706.
5 Sodek J，Ganss B，McKee MD.Osteopontin.Crit Rev Oral Biol Med，2000，11(3):279-303.
6 Hotte SJ，Winquist EW，Stitt L，et al.Plasma osteopontin:associations withsurvival and metastasis to bone in men with hormone-fefractory prostate carcinoma:Cancer，2002，1，95(3):506-512.
7 丁凌，郑树，曹江.大肠癌中骨桥蛋白的mRNA和蛋白表达及其与肝转移的关系.中华医学杂志，2002，82(14):970-973.
作者单位:310009浙江大学医学院附属第二医院肿瘤科
(收稿日期:2004-07-12)
(编辑双 庆), http://www.100md.com(丁 凌 郑 树 丁佳逸)
关键词 结直肠癌 骨桥蛋白 质粒
Construction of antisense-and sense-osteopontin eukaryotic expression plasmids
Ding Ling，Zheng Shu，Ding Jiayi.
Oncology section，2nd affiliated hospital，Zhejiang University，Hangzhou310009.
【Abstract】 Objective Construction of sense-and antisense-ostepontin ekuaryotic expression plamids.Methˉods Using RT-PCR method，pGEM-T Easy-OPN(antisense201bp)and pGEM-T Easy-OPN(ORF)were cloned.pcDNA3.1(+)-OPN(antisense201bp)and pcDNA3.1(+)-OPN(ORF)eukaryotic expression plasmids were contructed based on them.Results There plasmids were constructed and testified by enzymolysis and sequence scan.Conclusion The eukaryotic expression plamids provide experimental platform for following investigation on OPN and metastasis in colorectal carcinoma.
Key words colorectal neoplasm osteopontin plasmid
骨桥蛋白(osteopontin，OPN)基因定位在人类基因组的4q13和大鼠第5个染色本的ric基因上。人OPN基因cDNA编码区全长为945bp，所编码的骨桥蛋白分子量约为44kD [1] 。笔者前期实验工作中应用RT-PCR和实时荧光定量PCR方法证实:OPN mRNA在大肠癌肝转移组织中表达最高，大肠癌原发组织中次之，而在原发灶旁正常大肠粘膜组织中表达最低 [2] 。为进一步行细胞转染、原位杂交等以研究OPN与大肠癌肝转移的相关功能，笔者运用RT-PCR技术分别克隆两种OPN cDNA序列:pGEM-T Easy-OPN(反义201bp)和pGEM-T Easy-OPN(ORF)，并由此构建两种重组真核表达质粒:pcDˉNA3.1(+)-OPN(201bp)反义真核表达质粒和pcDˉNA3.1(+)-OPN(ORF)正义真核表达质粒。
1 材料
1.1 原核表达载体pGEM-T Easy，T4-DNA连接酶，Alkalin Phosphatase Calf intestinal购自Promega公司。
1.2 真核表达载体pcDNA3.1(+)购自Invitrogen
1.3 PCR产物回收试剂盒，购自QIACEN公司。
1.4 逆转录酶SUPER SCRIPTⅡ，限制性内切酶(Eco R I，Not I，Bam H I，PvuⅡ等)购自GIBCO公司。
1.5 大肠杆菌(E.Coli):DH5α，XL1-Blue由浙江大学肿瘤研究所提供。
2 方法
2.1 OPN cDNA序列克隆
2.1.1 RT-PCR 取术后离体大肠癌肝转移在液氮中研磨成粉，用Trizol法行RNA提取。运用分光光度仪及甲醛变性凝胶电泳检测RNA质量后，取RNA1μg，用SUPER SCRIPTⅡ进行逆转录，所得cDˉNA用于PCR扩增。OPN引物1:上游:5′>CAA ATA CCC AGA TGC TGT GGC<3′，下游5′>5′TCC TGG CTG TCC ACA TGG AC<3′(理论扩增片段201bp);OPN引物2上游:5′>CCG ACC AAG GAA AAC TCA CT<3′下游:5′>CTC CTTTTA ATTGAC CTC AG<3′(ORF:理论扩增片段为974bp)。PCR扩增条件:94℃5min，94℃30s，55℃45s，72℃30s，35个循环，循环结束后72℃延伸7min。紫光下将PCR电泳产物切胶，用PCR产物回收试剂盒QG法回收PCR产物，取适量回收产物行凝胶电泳鉴定。
2.1.2 T-A克隆 PCR产物用T4DNA ligase进行T-A克隆，并将10μl克隆连接产物加入50μl感受态细胞E.Coli)(DH5α)中，进行转化反应。用碱裂解法提取质粒DNA [3] ，干燥后TE溶解。
2.1.3 酶切及测序鉴定 构建之原核表达质粒pGEM-TEasy-OPN(201bp)和pEGM-TEasy-OPN(ORF)分别用EcoR I和Not I37℃水浴酶切过夜。酶切产物经凝胶电泳验证无误后，再将T-A克隆之质粒送测序证实。
2.2 OPN反义真核表达质粒的构建 pGEM-T Easy-OPN(201bp)酶切产物经凝胶电泳在紫外光下切胶，QG回收，并测定浓度。真核表达载体pc DNA3.1(+)用EcoR I酶切成线性结构后，为防止连接反应时自身环化，将之用Alkaline Phosphatase Calf intestinal进行去磷酸化，37℃反应30min，50℃反应30min，75℃反应10min，置冰上结束反应。而后用酚氯仿抽提回收，用70%预冷乙醇洗净后，加TE溶解。再将pGEM-T Easy-OPN(201bp)酶切产物与pc DNA3.1(+)-EcoR I酶切产物用T4DNA ligase连接，构建pcDNA3.1(+)-OPN(反应201bp)真核表达质粒。经E.Coli(DH5α)转化后，质粒提取，经EcoR I酶切及测序鉴定证实。
2.3 OPN正义真核表达质粒的构建 先用Not I将pc DNA3.1(+)切成线性后再用Alkaline Phosphatase Calf intestina去磷酸化，将之与经Not I酶切的pGEM-T Easy-OPN(ORF)行连接反应，构建pcDNA3.1(+)-OPN(ORF)真核表达质粒。经E.Coli(DH5α)转化后，质粒提取。并分析pcDNA3.1(+)-OPN(ORF)质粒酶切位点后，采用PvuⅡ和BamH I双酶切，电泳初步鉴定后经测序证实。
3 结果
3.1 pGEM-T Easy-OPN(反义201bp)酶切结果 见图1。
3.2 pcDNA3.1(+)-OPN(反义201bp)真核表达质粒酶切结果 见图2。
3.3 pGEM-T Easy-OPN(ORF)酶切及测序结果 见图3。
3.4 pcDNA3.1(+)-OPN(ORF)真核表质粒酶切及测序结果 见图4。
4 讨论
OPN是一种富含丝氨酸残基的磷酸化糖蛋白，其中含有特异的Arg-Gly-Asp序列(RGD)，这个序列是蛋白质分子中与细胞粘附有关的重要功能 图1 pGEM-T Easy-OPN(反义201bp)酶切鉴定结果 1-5经EcoR I酶切后均可见约OPN(201bp)酶切片段 图2 pcDNA3.1(+)-OPN(反义201bp)真核表达质粒酶切鉴定结果 1，3为经EcoR I酶切后，见约250酶切片段;2，4为酶切前的质粒 图3 pGEM-T Easy-OPN(ORF)酶切鉴定结果 1，DL2000;2，3，pGEM-T Easy-OPN(ORF)经Not I酶切 域 [4] 。OPN不仅与骨组织的矿化密切相关，而胜在许多非矿化组织中，如血管、内耳、肾、胆囊、胰腺、甚至在巨噬细胞和激活T淋巴细胞等中都发现了该蛋白的表达，还发现它与Ca 2+ 、NO - 等细胞信使、巨噬细胞趋化反应、平滑肌细胞增生及感染等多种生理、病理现象密切相关 [5] 。OPN与骨组织的矿化、泌尿系结石的形成和动脉粥样硬化等生理、病理现象的相关性已得到大量文献证实，而OPN与恶性肿瘤发生发展的关系特别是与肿瘤转移的相关性正日益引起人们的关注 [6] 。但对OPN在大肠癌肝转移中的相关机制研究，国内外尚没有相关报道。图4 pcDNA3.1(+)-ORF正义真核表达质粒酶切鉴定结果 3，4经PvuⅡ和BamHⅠ酶切，酶切片段正确 笔者曾应用RT-PCR和实时荧光定量PCR方法对44例大肠癌配对组织和20例大肠癌肝转移组织的OPN mRNA检测结果证实，OPN mRNA在大肠癌肝转移组织中表达最高，大肠癌原发组织中的次之，而在原发灶旁正常大肠粘膜中表达最低，证实了OPN与大肠癌肝转移的相关性。同时用免疫组化方法也发现OPN蛋白在绝大多数大肠癌细胞浆中表达阳性，癌旁正常粘膜表达阴性，在肝转移灶中大肠癌细胞浆表达阳性 [7] 。提示OPN可能与大肠癌的 肝转移有密切关系。 为制备PNA原位杂交探针以检测OPN mRNA在不同组织中的定位，并为研究OPN转移相关机制的细胞转染作准备，笔者通过本实验运用PT-PCR技术分别克隆了两种OPN cDNA序列:反义序列(201bp)和ORF(974bp)，并由此构建了两种重组真核表达质粒:pcDNA3.1(+)-OPN(201bp)反义真核表达质粒和pcDNA3.1(+)-OPN(ORF)正义真核表达质粒，酶切和测序结果均显示这两种重组质粒构建成功。为下一步研究OPN与大肠癌肝转移的相关机制提供了实验平台。
参考文献
1 Fet V，Dickinson ME，Hogan BL.Localization of the mousegeneforsecretedphosphoprotein1(Spp-1)(2ar，osteopontin，bone sialoprotein1，44-kDa bone phosphoproteintumorsecreted phosphoprotein)to chroˉmosome5，closely linked to Ric(Rickettsia resistance).Genomics，1989，5(2):375-377.
2 丁凌，郑树.骨桥蛋白在大肠癌和大肠癌肝转移中的表达及其临床意义.中华外科杂志，2002，40(10):773-775.
3 J.Sambrook，E.F.Fritsch，T.maniatis.Molecular Cloning，A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989.
4 Chambers AF，Hota C，Prince CW，et al.Adhesion of metastatic，ras-transformed NIH3T3cells to osteopontin，fibronectin，and laminin.Cancer Res，1993，53:701-706.
5 Sodek J，Ganss B，McKee MD.Osteopontin.Crit Rev Oral Biol Med，2000，11(3):279-303.
6 Hotte SJ，Winquist EW，Stitt L，et al.Plasma osteopontin:associations withsurvival and metastasis to bone in men with hormone-fefractory prostate carcinoma:Cancer，2002，1，95(3):506-512.
7 丁凌，郑树，曹江.大肠癌中骨桥蛋白的mRNA和蛋白表达及其与肝转移的关系.中华医学杂志，2002，82(14):970-973.
作者单位:310009浙江大学医学院附属第二医院肿瘤科
(收稿日期:2004-07-12)
(编辑双 庆), http://www.100md.com(丁 凌 郑 树 丁佳逸)