Vit C及非洛地平对急性心梗溶栓治疗中再灌注损伤的保护作用
【摘要】 目的 研究氧自由基清除剂(Vit C)及钙拮抗剂(非洛地平)对急性心梗溶栓治疗中再灌注损伤(RI)的作用，旨在为临床减轻RI，降低病死率，谋求心肌保护药物，并为RI的作用机制提供临床方面的实验依据。方法 AMI患者32例，随机分为4组:对照组、Vit C组、非洛地平组、Vit C+非洛地平组，静脉溶栓后冠脉再通19例。监护溶栓后6h内每组患者再灌注心律失常发生情况。分别于溶栓前即刻，溶栓后4、8、12、16、24h，以后每日1次测心肌酶。测定溶栓前及溶栓后2、4、12h时外周血中性粒细胞胞浆游离Ca 2+ ，血清丙二醛(MDA)超氧化物歧化酶(SOD)含量。结果 用Vit C组的再灌注心律失常发生率、心肌酶峰值(CK、GOT)均显著低于对照组(P<0.05)，溶栓后4、12h MDA含量明显低于对照组(分别:P<0.05，P<0.01)，而SOD含量则高于对照组(P<0.05)。用非洛地平组的再灌注心律失常发生率、心肌酶峰值、血清MDA及SOD含量与对照组相比差异均无显著性。溶栓后2h Ca 2+ 含量较对照组略有减低，但差异无显著性(P>0.05)。两药联用无交互作用。结论 Vit C可通过阻断氧自由基生成的链式反应，发挥其对心肌缺血再灌注损伤的保护作用。
Xian Yuqiong，Zheng Changzhu，Xu Xiuli，et al.
Department of Cardiology，Shanghai Seventh People’s Hospital，Shanghai200137.
【Abstract】 Objective In order to relieve reperfusion injury(RI)，decrease mortality，seek cardioprotective drugs，offer experiment reference for mechanism of reperfusion injury，Effects of oxygen free radical scavenger(Vit C)and calcium channel block(felodipine)on myocardial ischemia reperfusion injury in acute myocardial infarction paˉtients thrombolyticed therapy was studied.Methods 32patients with AMI were randomized into four groups:control group，Vit C group，Felodipine group，Vit.C+Felodipine group.The infarct related cononary artery of19patients were opened after intravenus thrombolytic therapy.Arrhythmias caused by reperfusion was observed in6hour after thromˉbolytic therapy.Myocardial enzymes(CK，GOT)were measured before thrombolytic and after4，8，12，16，24hour，one time a day.The contents of polymorphonuclear(PMN)cytoplasmic free calcium(Ca 2+ )，malondialdehyde(MDA)and superoxides dismutase(SOD)of serum in peripheral blood were measured before thrombolytic and after2，4，12hour.Results The incidence of reperfusion arrhythmias，the peak value of myocardial enzymes(CK，GOT)were lower in Vit C group than control group(P<0.05).The contents of MDA was lower(P<0.05，P<0.01respectively)，and which of SOD was higher(P<0.05)in Vit C group than control group in4，12hour after thrombolytic therapy.The incidence of reperfusion arrhythmias，the peak value of myocardial enzymes(CK，GOT)，the contents ofMDA and SOD in serm had not significant differences(P>0.05)in felodipine group than control group.The contents of Ca 2+ was lower than control group in2hour after thrombolytic therapy，but had not significant difference(P>0.05).The two drugs didn’t affect each other.Conclusion Vit C protect ischemic myocardium and reduce reperfusion injury through block the production of oxygen free radical.
Key words Ischemia-reperfusion injury cardioprotection Vit C felodipine
国内外基础和临床研究都证实，急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)早期进行再灌注治疗，使缺血心肌重新恢复血液循环，是挽救濒死心肌细胞，促进心功能恢复，降低病死率的根本措施。但再灌注损伤(reperfusion inˉjury，RI)直接降低了再灌注疗法的疗效，已为基础研究所证实。本实验针对RI的“氧自由基(Oxygen free radical，OFR)损伤”学说 [1，2] 和“钙超载”学说 [3，4] ，选用氧自由基清除剂(Vit C)及钙拮抗剂(非洛地平)，研究它们单独和联合作用时对AMI溶栓治疗时RI的作用。旨在为临床减轻AMI溶栓治疗过程中的RI，降低病死率，谋求心肌保护药物，并为RI的作用机制提供临床方面的实验依据。
1 材料与方法
1.1 临床资料 本院1999年6月～2002年3月期间由急诊入CCU的有溶栓适应证 [5] 的AMI患者32例，随机分为4组:对照组、Vit C组、非洛地平组、Vit C+非洛地平组。为增加可比性，每组患者的基础治疗基本相同，如低分子肝素(法安明)、阿司匹林、硝酸酯类(异舒吉)、β-受体阻滞剂(倍他乐克，无禁忌证者用)、极化液、营养心肌药物(FDP等)，对照组只给予基础及溶栓治疗。观察组除基础及溶栓治疗外，分别给予Vit C(4g，于溶栓前静脉滴)、非洛地平(5mg，于溶栓前口服)、Vit C+非洛地平药物治疗。溶栓剂使用尿激酶，静脉溶栓方法:尿激酶150万U+生理盐水100ml，30min内静脉滴入，按无创性冠状动脉再通标准判定 [5] ，再通共19例，未通13例。再通19例中男17例，女2例，年龄43～77岁，平均63.4±11.5岁，发病至溶栓时间平均5.3±4.0h。梗塞部位:前间壁心梗2例;广泛前壁心梗3例;广泛前壁+下壁心梗1例;广泛前壁+高侧壁心梗2例;广泛前壁+高侧壁+右室心梗1例;高侧壁心梗1例;下壁心梗8例;下壁+右室心梗1例。19例再通者中，每组分布如下:对照组4例、Vit C组、非洛地平组、Vit C组+非洛地平组各5例。每组患者的性别、年龄、发病至溶栓时间、心功能级别、伴发疾病(如糖尿病、高血压病等)、基础治疗均差异无显著性(P>0.05)。
1.2 方法 每例患者分别于溶栓前即刻、溶栓后每0.5h，至溶栓后2、4、8、16和24h，以后每日1次作心电图(心电图机:上海光电医用电子仪器有限公司生产，型号:ECG-81109)，于溶栓前即刻和溶栓后4、8、12、16、24h，以后每日1次测心肌酶(CK，用南京波音特生物科技有限公司生产的试剂盒采用连续测定法测定;CK-MB，用罗氏制药厂生产的试剂盒采用免疫抑制法测定;LDH，用南京波音特生物科技有限公司生产的试剂盒采用乳酸连续测定法测定;GOT，采用连续测定法测定。所用仪器:717型全自动生化分析仪)和TnT(用单克隆免疫斑点法测)，再通组于溶栓前即刻，溶栓后2、4、12h取静脉血3ml(抗凝)，分离中性粒细胞 [6] 并测定胞浆内游离Ca 2+ ，丙二醛(MDA)，超氧化物歧化酶(SOD)含量，整个实验过程由专人监护(监护仪:Drager，made in C.E.E，Fabr.No.SRLC-0006)心电变化，记录出现何种心律失常及其持续时间、血压、用药情况等。
1.2.1 外周血中性粒细胞分离方法 将3ml肝素抗凝的静脉血离心15min(2000r/min)，然后吸取富含白细胞的“白膜层”，以等量0.15M的pH为7.4的PBS液稀释，加1～4倍粒细胞分离液，水平离心20min(2000r/min)，取位于分离液界面上的白细胞层带，以吸管小心移入另一试管，以PBS稀释至分离前的体积。加淋巴细胞分离液，离心20min(2000r/min)，则沉于管底的为粒细胞。
1.2.2 中性粒细胞胞浆游离Ca 2+ 测定方法 经过分离的中性粒细胞置于1ml无血清无酚红培养液中，将中性粒细胞沉淀于用多聚赖氨酸处理过的测试小室内，加入10μl用无水二甲基亚砜(DMSO)配成的浓度为1mg/ml的Fluo-3AM，在37℃的CO 2 培养箱孵浴30min，用无荧光探针的培养液洗脱2次。用Fluo-3AM荧光探针测量钙离子浓度为单波长测量，其激发波长为490nm，其发射波长为425nm，本实验使用德国ZEISS公司的510型激光共聚焦显微镜，测试时使用激发波长为488nm的氩离子激光，用505-530nm 的带通滤波片作为发射波片。将承载经过荧光探针孵育的中性粒细胞的测试小室放置在37℃恒温的测试台上，将进液和出液管接入测试小室，通过蠕动泵控制台试液的流量，先后将正常台试液、无钙台试液、高钙台试液注入测试小室，分别测得其荧光强度。
计算公式为:[Ca 2+ ]=Kd(F-F min )/(F max -F)
注:Kd为荧光探针钙解离常数，Fluo-3AM为400;F在正常台试液中测的荧光强度;F min 在无钙台试液中并含有EGTA(10mmol/L)和A-23187(10μmol/L)测的荧光强度;F max 在钙浓度为2mmol/L台试液中并加入A-23187(10μmol/L)测的荧光强度。
1.2.3 血清超氧化物歧化酶(SOD)含量测定方法 将分离的血清置于-50℃冰箱中待测(3周内测)，采用南京建成生物工程研究所研制的SOD测定试剂盒进行测定。测定原理:通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基(O 2 )，后者氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈现紫色，用Hitachi，u2000型分光光度计测其吸光度，在波长550nm处比色。当被测样品含SOD时，则对超氧阴离子自由基(O 2 )有专一性的抑制作用，使形成的亚硝酸盐减少，比色时测定管的吸光度低于对照管的吸光度，通过公式计算可求出被测样品中的SOD活力。
1.2.4 血清丙二醛(MDA)测定方法 同样将分离的血清置于-50℃冰箱中待测(3周内测)，采用南京建成生物工程研究所研制的MDA测定试剂盒进行测定。测定原理:过氧化脂质降解产物中的丙二醛(MDA)可与硫代巴比妥酸(TBA)缩合，形成红色产物，在532nm处有最大吸收峰。用Hitachi，u2000型分光光度计进行测量。
1.3 药品与试剂 “尿激酶”由上海第一生物制药厂生产;“Vit C”针剂由上海禾丰制药有限公司生产;“非洛地平”、“倍他乐克”片剂由阿斯特拉(无锡)制药有限公司生产;“法安明”由法玛西亚普强(中国)有限公司生产;“阿司匹林”由上海信宜百路达药业有限公司生产;“异舒吉”、“长效异乐定”由许瓦滋(珠海)制药有限公司生产;注射用“果糖二磷酸钠(FDP)”由上海新亚药业有限公司生产。
1.4 统计方法 所有数据以均数±标准差(X±s)表示。各实验组观察值用2×2析因设计(factorial design)的方差分析法检验组间是否有差异，进一步用Neuman-keuls法作q检验。各指标间作相关与回归分析，P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 中性粒细胞胞浆游离Ca 2+ 含量，见图1。
图1 中性粒细胞胞浆游离Ca 2+ 含量(略)
2.2 血清丙二醛(MDA)含量，见图2
图2 血清MDA含量(略)
注:与同期对照组相比 ˇ P<0.05， ˇˇ P<0.01， 与同组溶栓前相比 # P<0.05， ## P<0.01
2.3 血清超氧化物歧化酶(SOD)含量，见图3。
图3 血清SOD含量(略)
注:与同期对照组相比 ˇ P<0.05; 与同组溶栓前相比 # P<0.05
2.4 溶栓治疗6h内心律失常发生情况:用多功能心电和血压监护仪，由专人监护心电变化，并随时记录心律失常发生的类型、次数及持续时间。
表4 溶栓治疗6h内心律失常发生情况的比较(略)
注:AIVR(accelerated idioventricular rhythm):加速性室性自主心律;VT:室性心动过速;VF:室颤;VP:室早;AVB:房室传导阻滞; ˇ :表示与不用Vit C相比P<0.05
2.5 各组溶栓前及溶栓后CK、GOT峰值比较，见图4
图4 各组溶栓前及溶栓后CK、GOT峰值的比较(略)
注:与同期对照组相比 ˇ P<0.05
3 讨论
目前认为:心肌缺血再灌注损伤发生的主要机制是氧自由基损伤 [1，2，7] 与细胞内钙超载 [3，4]。此两者之间可能又存在着某种潜在的关系 [8] 。如何减小AMI病人溶栓及冠脉介入治疗中的RI已成为亟待解决的问题。而临床上因获取心肌标本困难，致使有关RI方面的研究受限。最近有研究表明 [9，10] :可用外周血中性粒细胞胞游离Ca 2+ 、血清丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)来反映心肌细胞内相应成分的变化，作为判断心肌缺血RI的指标。本实验研究了氧自由基清除剂-Vit C或(和)钙拮抗剂-非洛地平对AMI患者溶栓前、后外周血中性粒细胞胞浆内游离Ca 2+ 、血清中OFR引起生物膜脂质过氧化反应的终末代谢产物-丙二醛(MDA)、内源性自由基清除剂-超氧化物歧化酶(SOD)的影响，以及对反映再灌注损伤严重程度的再灌注心律失常、心肌酶的影响。
研究结果揭示:不用Vit C时(对照组和非洛地平组)的MDA含量在溶栓后4、12h明显高于溶栓前(分别:P<0.05，P<0.01)，亦明显高于同期用Vit C时(Vit C组和Vit C+非洛地平组)(分组:P<0.05，P<0.01)。此与Tavazzi [11] 和Barta [12] 的报道一致。同时，溶栓后4、12h，不用Vit C组(对照组和非洛地平组)的内源怀SOD活性明显低于溶栓前(P<0.05)，用Vit组(Vit C组和Vit C+非洛地平组)虽然亦有降低趋势，但明显高于同期不用Vit C组的SOD含量(P<0.05)。同时，用Vit C组的再灌注心律失常情况轻于对照组，心肌酶峰值(CK、GOT)亦低于对照组(P<0.05)。
正常情况下，机体内含有一定量的OFR，但由于存在内源性OFR清除剂SOD，因此不至于损伤正常细胞。缺血、再灌注时SOD消耗增多，生成量减少，同时，通过黄嘌呤途径生成较多的OFR。OFR可引起心肌细胞膜、线粒体膜等生物膜上多价不饱和脂肪酸脂质过氧化分解，从而损伤生物膜，并引起其它细胞毒性反应 [13] 。本研究结果表明:冠脉再通后OFR引起的脂质过氧化分解作用增强，内源性OFR清除剂(SOD)的消耗增加。Vit C可通过抑制脂质过氧化分解作用和清除OFR而发挥其对心肌缺血再灌注损伤的保护作用。业已证明，Vit C可阻断OFR生成的链式反应，并能很快与自由基-超氧阴离子(O 2 )和H 2 O·反应生成抗坏血酸自由基，后者性质不活泼，还可清除自由基-单线态氧(O 2 )和羟自由基(·OH)。另外，Vit C能通过促进人冠状动脉内皮细胞ON的合成 [14] 及抵抗血管紧张素Ⅱ的缩血管作用 [15] ，而起到改善血管内皮细胞舒张功能的作用。VitC还具有促进胶原纤维和血管内皮细胞粘合物质形成的作用，因此，Vit C可改善冠脉血供，保持细胞间质完整性，增加毛细血管致密性，减轻其通透性，提高其对缺血的耐受性，减少出血、水肿的发生。
本研究结果还表明:溶栓后2h外周血中性粒细胞胞浆内游离Ca 2+ 在不用非洛地平组比溶栓前明显增加，用非洛地平组(非洛地平组和非洛地平+Vit C)虽然亦有增加，但轻于前者，差异无显著性(P>0.05)。表明非洛地平可能具有一定程度地抑制细胞内Ca 2+ 超载的作用。它可能是通过双氢吡啶类钙通道来阻断Ca 2+ 内流的。业已证明，非洛地平可抑制由细胞外Ca 2+ 过多地进入细胞所引起的血管平滑肌的收缩，从而扩张冠状动脉，缓解冠脉痉挛，增加冠脉血流。同时，可通过扩张系统血管来降低心脏射血阻力 (后负荷)，降低缺血心肌氧耗，保存缺血时珍贵的能源。因此推测对心肌缺血再灌注损伤可能具有一定的保护作用。本研究差异无显著性可能与样本量有限有关。另外，经统计VitC和非洛地平两药无交互作用。各指标间亦无明显的相关关系。
由此可见:Vit C可通过阻断氧自由基生成的链式反应，抑制氧自由基损伤而发挥其对心肌缺血再灌注损伤的保护作用。Vit C是天然的抗氧化剂，且价廉易购，因此不失为防治再灌注损伤的有效方法之一。但是，VitC的给药剂量合适与否，量效关系如何，最佳给药及用药时间等问题尚有待进一步探讨。目前，预防细胞内钙超载的药物之一是钙拮抗剂，它是一类能选择性地阻滞Ca 2+ 经细胞膜上慢钙通道进入细胞内的药物。一些动物实验证实，钙拮抗剂(如:nifedipine，verapamil，diltiazem)能有效地预防细胞内钙超载 [16～19] 。临床上选择何种药物来预防细胞内“钙超载”，尚需进一步研究。
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(收稿日期:2004-03-29)
ˇ 基金项目:上海市浦东新区社会发展局资助项目(编号:PW-99-13)
作者单位:200137上海市第七人民医院心内科
上海第二医科大学生殖内分泌重点实验室
新疆博乐市州医院急诊室
(编辑江 风), http://www.100md.com(鲜玉琼 郑昌柱 许秀丽 金玲香 郭强苏 王玉华 唐岚)
Xian Yuqiong，Zheng Changzhu，Xu Xiuli，et al.
Department of Cardiology，Shanghai Seventh People’s Hospital，Shanghai200137.
【Abstract】 Objective In order to relieve reperfusion injury(RI)，decrease mortality，seek cardioprotective drugs，offer experiment reference for mechanism of reperfusion injury，Effects of oxygen free radical scavenger(Vit C)and calcium channel block(felodipine)on myocardial ischemia reperfusion injury in acute myocardial infarction paˉtients thrombolyticed therapy was studied.Methods 32patients with AMI were randomized into four groups:control group，Vit C group，Felodipine group，Vit.C+Felodipine group.The infarct related cononary artery of19patients were opened after intravenus thrombolytic therapy.Arrhythmias caused by reperfusion was observed in6hour after thromˉbolytic therapy.Myocardial enzymes(CK，GOT)were measured before thrombolytic and after4，8，12，16，24hour，one time a day.The contents of polymorphonuclear(PMN)cytoplasmic free calcium(Ca 2+ )，malondialdehyde(MDA)and superoxides dismutase(SOD)of serum in peripheral blood were measured before thrombolytic and after2，4，12hour.Results The incidence of reperfusion arrhythmias，the peak value of myocardial enzymes(CK，GOT)were lower in Vit C group than control group(P<0.05).The contents of MDA was lower(P<0.05，P<0.01respectively)，and which of SOD was higher(P<0.05)in Vit C group than control group in4，12hour after thrombolytic therapy.The incidence of reperfusion arrhythmias，the peak value of myocardial enzymes(CK，GOT)，the contents ofMDA and SOD in serm had not significant differences(P>0.05)in felodipine group than control group.The contents of Ca 2+ was lower than control group in2hour after thrombolytic therapy，but had not significant difference(P>0.05).The two drugs didn’t affect each other.Conclusion Vit C protect ischemic myocardium and reduce reperfusion injury through block the production of oxygen free radical.
Key words Ischemia-reperfusion injury cardioprotection Vit C felodipine
国内外基础和临床研究都证实，急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)早期进行再灌注治疗，使缺血心肌重新恢复血液循环，是挽救濒死心肌细胞，促进心功能恢复，降低病死率的根本措施。但再灌注损伤(reperfusion inˉjury，RI)直接降低了再灌注疗法的疗效，已为基础研究所证实。本实验针对RI的“氧自由基(Oxygen free radical，OFR)损伤”学说 [1，2] 和“钙超载”学说 [3，4] ，选用氧自由基清除剂(Vit C)及钙拮抗剂(非洛地平)，研究它们单独和联合作用时对AMI溶栓治疗时RI的作用。旨在为临床减轻AMI溶栓治疗过程中的RI，降低病死率，谋求心肌保护药物，并为RI的作用机制提供临床方面的实验依据。
1 材料与方法
1.1 临床资料 本院1999年6月～2002年3月期间由急诊入CCU的有溶栓适应证 [5] 的AMI患者32例，随机分为4组:对照组、Vit C组、非洛地平组、Vit C+非洛地平组。为增加可比性，每组患者的基础治疗基本相同，如低分子肝素(法安明)、阿司匹林、硝酸酯类(异舒吉)、β-受体阻滞剂(倍他乐克，无禁忌证者用)、极化液、营养心肌药物(FDP等)，对照组只给予基础及溶栓治疗。观察组除基础及溶栓治疗外，分别给予Vit C(4g，于溶栓前静脉滴)、非洛地平(5mg，于溶栓前口服)、Vit C+非洛地平药物治疗。溶栓剂使用尿激酶，静脉溶栓方法:尿激酶150万U+生理盐水100ml，30min内静脉滴入，按无创性冠状动脉再通标准判定 [5] ，再通共19例，未通13例。再通19例中男17例，女2例，年龄43～77岁，平均63.4±11.5岁，发病至溶栓时间平均5.3±4.0h。梗塞部位:前间壁心梗2例;广泛前壁心梗3例;广泛前壁+下壁心梗1例;广泛前壁+高侧壁心梗2例;广泛前壁+高侧壁+右室心梗1例;高侧壁心梗1例;下壁心梗8例;下壁+右室心梗1例。19例再通者中，每组分布如下:对照组4例、Vit C组、非洛地平组、Vit C组+非洛地平组各5例。每组患者的性别、年龄、发病至溶栓时间、心功能级别、伴发疾病(如糖尿病、高血压病等)、基础治疗均差异无显著性(P>0.05)。
1.2 方法 每例患者分别于溶栓前即刻、溶栓后每0.5h，至溶栓后2、4、8、16和24h，以后每日1次作心电图(心电图机:上海光电医用电子仪器有限公司生产，型号:ECG-81109)，于溶栓前即刻和溶栓后4、8、12、16、24h，以后每日1次测心肌酶(CK，用南京波音特生物科技有限公司生产的试剂盒采用连续测定法测定;CK-MB，用罗氏制药厂生产的试剂盒采用免疫抑制法测定;LDH，用南京波音特生物科技有限公司生产的试剂盒采用乳酸连续测定法测定;GOT，采用连续测定法测定。所用仪器:717型全自动生化分析仪)和TnT(用单克隆免疫斑点法测)，再通组于溶栓前即刻，溶栓后2、4、12h取静脉血3ml(抗凝)，分离中性粒细胞 [6] 并测定胞浆内游离Ca 2+ ，丙二醛(MDA)，超氧化物歧化酶(SOD)含量，整个实验过程由专人监护(监护仪:Drager，made in C.E.E，Fabr.No.SRLC-0006)心电变化，记录出现何种心律失常及其持续时间、血压、用药情况等。
1.2.1 外周血中性粒细胞分离方法 将3ml肝素抗凝的静脉血离心15min(2000r/min)，然后吸取富含白细胞的“白膜层”，以等量0.15M的pH为7.4的PBS液稀释，加1～4倍粒细胞分离液，水平离心20min(2000r/min)，取位于分离液界面上的白细胞层带，以吸管小心移入另一试管，以PBS稀释至分离前的体积。加淋巴细胞分离液，离心20min(2000r/min)，则沉于管底的为粒细胞。
1.2.2 中性粒细胞胞浆游离Ca 2+ 测定方法 经过分离的中性粒细胞置于1ml无血清无酚红培养液中，将中性粒细胞沉淀于用多聚赖氨酸处理过的测试小室内，加入10μl用无水二甲基亚砜(DMSO)配成的浓度为1mg/ml的Fluo-3AM，在37℃的CO 2 培养箱孵浴30min，用无荧光探针的培养液洗脱2次。用Fluo-3AM荧光探针测量钙离子浓度为单波长测量，其激发波长为490nm，其发射波长为425nm，本实验使用德国ZEISS公司的510型激光共聚焦显微镜，测试时使用激发波长为488nm的氩离子激光，用505-530nm 的带通滤波片作为发射波片。将承载经过荧光探针孵育的中性粒细胞的测试小室放置在37℃恒温的测试台上，将进液和出液管接入测试小室，通过蠕动泵控制台试液的流量，先后将正常台试液、无钙台试液、高钙台试液注入测试小室，分别测得其荧光强度。
计算公式为:[Ca 2+ ]=Kd(F-F min )/(F max -F)
注:Kd为荧光探针钙解离常数，Fluo-3AM为400;F在正常台试液中测的荧光强度;F min 在无钙台试液中并含有EGTA(10mmol/L)和A-23187(10μmol/L)测的荧光强度;F max 在钙浓度为2mmol/L台试液中并加入A-23187(10μmol/L)测的荧光强度。
1.2.3 血清超氧化物歧化酶(SOD)含量测定方法 将分离的血清置于-50℃冰箱中待测(3周内测)，采用南京建成生物工程研究所研制的SOD测定试剂盒进行测定。测定原理:通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基(O 2 )，后者氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈现紫色，用Hitachi，u2000型分光光度计测其吸光度，在波长550nm处比色。当被测样品含SOD时，则对超氧阴离子自由基(O 2 )有专一性的抑制作用，使形成的亚硝酸盐减少，比色时测定管的吸光度低于对照管的吸光度，通过公式计算可求出被测样品中的SOD活力。
1.2.4 血清丙二醛(MDA)测定方法 同样将分离的血清置于-50℃冰箱中待测(3周内测)，采用南京建成生物工程研究所研制的MDA测定试剂盒进行测定。测定原理:过氧化脂质降解产物中的丙二醛(MDA)可与硫代巴比妥酸(TBA)缩合，形成红色产物，在532nm处有最大吸收峰。用Hitachi，u2000型分光光度计进行测量。
1.3 药品与试剂 “尿激酶”由上海第一生物制药厂生产;“Vit C”针剂由上海禾丰制药有限公司生产;“非洛地平”、“倍他乐克”片剂由阿斯特拉(无锡)制药有限公司生产;“法安明”由法玛西亚普强(中国)有限公司生产;“阿司匹林”由上海信宜百路达药业有限公司生产;“异舒吉”、“长效异乐定”由许瓦滋(珠海)制药有限公司生产;注射用“果糖二磷酸钠(FDP)”由上海新亚药业有限公司生产。
1.4 统计方法 所有数据以均数±标准差(X±s)表示。各实验组观察值用2×2析因设计(factorial design)的方差分析法检验组间是否有差异，进一步用Neuman-keuls法作q检验。各指标间作相关与回归分析，P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 中性粒细胞胞浆游离Ca 2+ 含量，见图1。
图1 中性粒细胞胞浆游离Ca 2+ 含量(略)
2.2 血清丙二醛(MDA)含量，见图2
图2 血清MDA含量(略)
注:与同期对照组相比 ˇ P<0.05， ˇˇ P<0.01， 与同组溶栓前相比 # P<0.05， ## P<0.01
2.3 血清超氧化物歧化酶(SOD)含量，见图3。
图3 血清SOD含量(略)
注:与同期对照组相比 ˇ P<0.05; 与同组溶栓前相比 # P<0.05
2.4 溶栓治疗6h内心律失常发生情况:用多功能心电和血压监护仪，由专人监护心电变化，并随时记录心律失常发生的类型、次数及持续时间。
表4 溶栓治疗6h内心律失常发生情况的比较(略)
注:AIVR(accelerated idioventricular rhythm):加速性室性自主心律;VT:室性心动过速;VF:室颤;VP:室早;AVB:房室传导阻滞; ˇ :表示与不用Vit C相比P<0.05
2.5 各组溶栓前及溶栓后CK、GOT峰值比较，见图4
图4 各组溶栓前及溶栓后CK、GOT峰值的比较(略)
注:与同期对照组相比 ˇ P<0.05
3 讨论
目前认为:心肌缺血再灌注损伤发生的主要机制是氧自由基损伤 [1，2，7] 与细胞内钙超载 [3，4]。此两者之间可能又存在着某种潜在的关系 [8] 。如何减小AMI病人溶栓及冠脉介入治疗中的RI已成为亟待解决的问题。而临床上因获取心肌标本困难，致使有关RI方面的研究受限。最近有研究表明 [9，10] :可用外周血中性粒细胞胞游离Ca 2+ 、血清丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)来反映心肌细胞内相应成分的变化，作为判断心肌缺血RI的指标。本实验研究了氧自由基清除剂-Vit C或(和)钙拮抗剂-非洛地平对AMI患者溶栓前、后外周血中性粒细胞胞浆内游离Ca 2+ 、血清中OFR引起生物膜脂质过氧化反应的终末代谢产物-丙二醛(MDA)、内源性自由基清除剂-超氧化物歧化酶(SOD)的影响，以及对反映再灌注损伤严重程度的再灌注心律失常、心肌酶的影响。
研究结果揭示:不用Vit C时(对照组和非洛地平组)的MDA含量在溶栓后4、12h明显高于溶栓前(分别:P<0.05，P<0.01)，亦明显高于同期用Vit C时(Vit C组和Vit C+非洛地平组)(分组:P<0.05，P<0.01)。此与Tavazzi [11] 和Barta [12] 的报道一致。同时，溶栓后4、12h，不用Vit C组(对照组和非洛地平组)的内源怀SOD活性明显低于溶栓前(P<0.05)，用Vit组(Vit C组和Vit C+非洛地平组)虽然亦有降低趋势，但明显高于同期不用Vit C组的SOD含量(P<0.05)。同时，用Vit C组的再灌注心律失常情况轻于对照组，心肌酶峰值(CK、GOT)亦低于对照组(P<0.05)。
正常情况下，机体内含有一定量的OFR，但由于存在内源性OFR清除剂SOD，因此不至于损伤正常细胞。缺血、再灌注时SOD消耗增多，生成量减少，同时，通过黄嘌呤途径生成较多的OFR。OFR可引起心肌细胞膜、线粒体膜等生物膜上多价不饱和脂肪酸脂质过氧化分解，从而损伤生物膜，并引起其它细胞毒性反应 [13] 。本研究结果表明:冠脉再通后OFR引起的脂质过氧化分解作用增强，内源性OFR清除剂(SOD)的消耗增加。Vit C可通过抑制脂质过氧化分解作用和清除OFR而发挥其对心肌缺血再灌注损伤的保护作用。业已证明，Vit C可阻断OFR生成的链式反应，并能很快与自由基-超氧阴离子(O 2 )和H 2 O·反应生成抗坏血酸自由基，后者性质不活泼，还可清除自由基-单线态氧(O 2 )和羟自由基(·OH)。另外，Vit C能通过促进人冠状动脉内皮细胞ON的合成 [14] 及抵抗血管紧张素Ⅱ的缩血管作用 [15] ，而起到改善血管内皮细胞舒张功能的作用。VitC还具有促进胶原纤维和血管内皮细胞粘合物质形成的作用，因此，Vit C可改善冠脉血供，保持细胞间质完整性，增加毛细血管致密性，减轻其通透性，提高其对缺血的耐受性，减少出血、水肿的发生。
本研究结果还表明:溶栓后2h外周血中性粒细胞胞浆内游离Ca 2+ 在不用非洛地平组比溶栓前明显增加，用非洛地平组(非洛地平组和非洛地平+Vit C)虽然亦有增加，但轻于前者，差异无显著性(P>0.05)。表明非洛地平可能具有一定程度地抑制细胞内Ca 2+ 超载的作用。它可能是通过双氢吡啶类钙通道来阻断Ca 2+ 内流的。业已证明，非洛地平可抑制由细胞外Ca 2+ 过多地进入细胞所引起的血管平滑肌的收缩，从而扩张冠状动脉，缓解冠脉痉挛，增加冠脉血流。同时，可通过扩张系统血管来降低心脏射血阻力 (后负荷)，降低缺血心肌氧耗，保存缺血时珍贵的能源。因此推测对心肌缺血再灌注损伤可能具有一定的保护作用。本研究差异无显著性可能与样本量有限有关。另外，经统计VitC和非洛地平两药无交互作用。各指标间亦无明显的相关关系。
由此可见:Vit C可通过阻断氧自由基生成的链式反应，抑制氧自由基损伤而发挥其对心肌缺血再灌注损伤的保护作用。Vit C是天然的抗氧化剂，且价廉易购，因此不失为防治再灌注损伤的有效方法之一。但是，VitC的给药剂量合适与否，量效关系如何，最佳给药及用药时间等问题尚有待进一步探讨。目前，预防细胞内钙超载的药物之一是钙拮抗剂，它是一类能选择性地阻滞Ca 2+ 经细胞膜上慢钙通道进入细胞内的药物。一些动物实验证实，钙拮抗剂(如:nifedipine，verapamil，diltiazem)能有效地预防细胞内钙超载 [16～19] 。临床上选择何种药物来预防细胞内“钙超载”，尚需进一步研究。
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(收稿日期:2004-03-29)
ˇ 基金项目:上海市浦东新区社会发展局资助项目(编号:PW-99-13)
作者单位:200137上海市第七人民医院心内科
上海第二医科大学生殖内分泌重点实验室
新疆博乐市州医院急诊室
(编辑江 风), http://www.100md.com(鲜玉琼 郑昌柱 许秀丽 金玲香 郭强苏 王玉华 唐岚)