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编号:10583646
转染促血管生成素-1基因的肝癌细胞对血管内皮细胞的趋化作用 ˇ
http://www.100md.com 《中华现代外科学杂志》 2004年第4期
     Peng Lin,Wang Weidong,Sun Jian.

    Department of Hepatobiliary Surgery,Guangdong Provincial People’s Hospital,Guangzhou510080

    【Abstract】 Objective To observe the chemotactic role on umbilical vein endothelial cells(UVECs)of SMMC7721hepatic carcinoma cells with angiopoietin gene expression and provide the basic work for further research of angiopoietin on hepatocellular carcinoma angiogenesis.Methods Lipofectamine induced gene transfection method was used to transfect angiopoietin gene fragment into SMMC7721cell line,which was proved to have no angiopoietin expresˉsion.Through the microchemotaxis analysis,we could observe the chemotactic role on umbilical vein endothelial cells.Results The chemotactic response of the umbilical vein endothelial cells was obviously improved with ang-1expression(P<0.05).The chemotactic effect seemed to be inhabited by Ang-1antibody.Conclusion Ang-1is a sort of chemotactic factor for vascular endothelial cell and a kind of promoter for angiogenesis.

    Key words angiopoietin hepatic carcinoma cell line chemotaxis

    实体肿瘤的生长、侵袭及转移与新生血管的形成有密切的关系,抑制新生血管的形成不仅能够防止肿瘤的侵袭及转移,而且可以使肿瘤消退。近来发展很快的抗血管生成疗法就是以此设想为基础的。原发性肝癌是一种血供较丰富的实体肿瘤,目前国内外对肝癌血管形成的研究尚处于起步阶段。在本实验中,我们通过脂质体介导的基因转染方法将促血管生成素(Angiopoietin)基因导入SMMC7721肝癌细胞系,采用原代培养的方法建立脐静脉内皮细胞系(UVEC),通过小孔趋化实验分析了转染Anˉgiopoietin-1基因前后SMMC7721肝癌细胞系对脐静脉内皮细胞的趋化作用。

    1 材料和方法

    1.1 Angiopoietin基因导入肝癌细胞系SMMC7721(脂质体载体介导法) 肝癌细胞系SMMC7721用购于武汉大学中国典型培养物保藏中心,培养于含20%胎牛血清的DMEM培养基中,并置于95%O 2 ,5%CO 2 ,37℃培养箱中至肝癌细胞系呈对数生长期时应用。0.25%胰蛋白酶消化收集SMMC7721细胞,将10 5 个细胞悬浮于2ml含10%胎牛血清的DMEM培养基中,转种于35mm培养皿中。培养12~24h使细胞达到50%~80%融合。在无菌玻璃试管中制备下列转染液:将10μg含Angiopoietin基因片段的质粒DNA(美国Regeneron Pharmaceuticals构建并赠送)溶于100μl无血清培养基中;另取20μl脂质体Lipofectamine2000稀释于80μl无血清培养基中。合并上述两种溶液,室温下放置15min备用。弃去培养皿中的细胞培养液,用无血清培养基洗涤细胞1次。加入0.8ml无血清培养基至Lipofectamine-DNA混合物中混匀后,小心滴加至细胞上均匀铺开。置于37℃,5%CO 2 培养箱中培养16h。弃去转染液,加入2ml标准培养液继续培养48h后,更换选择性培养基G418进行筛选并构建出稳定表达的细胞系。

    1.2 原代培养脐静脉内皮细胞 取产后新鲜脐带,无菌条件下剪取10~15cm一段。用无菌注射器吸取温PBS溶液注入脐静脉中洗净残余血液。用血管钳夹紧脐带一端,从另一端向脐静脉中徐徐注入终浓度为0.1%的胶原酶。待末端出现液体后结扎脐带两端使胶原酶充满血管消化3~10min。吸出含有内皮细胞的消化液注入离心管中,再注入温PBS溶液冲洗2~3次以获取更多的细胞一并注入离心管中,1000r/min离心15min。吸出上清液,加入含20%胎牛血清的DMEM培养基制成细胞悬液,接种入培养瓶。放入37℃,5%CO 2 的培养箱中培养。一般2~3d内细胞即可长成单层,将细胞继续培养传2~3代后即可用于下一步实验。

    1.3 小孔趋化实验 采用的48孔MicroBoyden微孔膜小室趋化板为美国Neuroprobe公司产品。具体过程如下:消化收集培养2~3代之脐静脉内皮细胞记数调节至10 5 ~10 6 /ml密度备用。向趋化板底板各孔加入250μl预先收集好的培养SMMC7721细胞的上清液。将无DVP的聚碳酸膜(8μm,Whatman,German)覆盖在SMMC7721细胞上清液上。依次盖上硅胶板和顶板并固定好。在顶板各孔中加入250μl脐静脉内皮细胞悬液,在37℃,5%CO 2 的培养箱中培养2h。吸去顶板各孔的培养液,松开螺丝,将整个装置反转平放。小心提起底板,注意不要移动滤膜,此时已有细胞迁移的一面朝上。取下滤膜,用PBS冲洗无细胞的一面,用橡皮擦去没有迁移的细胞。70%甲醇固定膜上细胞45min,取出滤膜晾干,苏木素染色8~10h。取出漂洗、晾干,高倍镜下记数细胞。一般记数3个高倍视野下全部细胞取其平均值。往趋化底板微孔中加入经Angiopoietin抗体处理的细胞培养液,重复进行Angiopoietin抗体抑制实验。

    1.4 统计学处理 实验结果以ˉx±s表示,采用SAS统计分析软件行t检验和方差分析,检验水准α=0.05。

    2 结果

    2.1 原代培养情况 脐静脉内皮细胞生长后,开始细胞呈梭形,类似成纤维细胞,连接成片后开始出现内皮细胞形态。由于脐静脉内皮细胞的传代能力不是很强,因此我们采用2~3代之细胞。

    2.2 Angiopoietin对脐静脉血管内皮细胞的趋化作 用结果 基因转染前SMMC7721肝癌细胞培养1、3、5、7天使脐静脉内皮细胞迁移数平均为21±2个/HPF,转染Ang-1基因后的SMMC7721肝癌细胞使脐静脉内皮细胞迁移数平均为62±3个/HPF,与转染前相比有显著性差异(P<0.05);加入抗体阻断Ang-1对脐静脉血管内皮细胞的趋化作用:Ang-1对血管内皮细胞的趋化作用明显受到抑制,转染前后相比已无明显差别。

    3 讨论

    目前已知血管内皮细胞上有两大类特异性酪氨酸激酶受体系统,一类是Flt(Flk)/VEGF-R家族,另一类酪氨酸激酶受体家族Tie包括Tie1和Tie2/Tek两种。Ang-1和Ang-2是近年来发现的Tie2受体的配体 [1] 。和VEGF不同,Ang-1和受体的结合并不促进血管内皮细胞的增殖,而是通过调节内皮细胞与周围间质细胞的相互作用而发挥维持血管稳定,促进新生血管成熟化的作用。Angiopoietin/Tie2系统在胚胎时期是血管形成的另一信息通道,其在成熟机体和病理情况下的作用尚有待阐明。趋化作用(Chemotaxis)是指细胞沿着组织内化学刺激物的浓度梯度做定向运动的过程。由于血管内皮细胞上有Angiopoietin的特异性受体,我们设想转基因后的肝癌细胞可能对血管内皮细胞产生一定的趋化作用。我们的研究表明,Ang-1对血管内皮细胞具有趋化作用。这一现象提示出两点:(1)虽然Ang-1对胚胎时期血管生成的作用已经得到基因敲除实验的证实,但对于成熟机体较稳定的血管Ang-1究竟有何种影响尚缺乏有力的证据。胚胎时期如果阻断VEGF受体则胚胎中缺乏血管内皮细胞[2] ,如果阻断Tie2受体虽然胚胎中仍有血管内皮细胞的形成,但生成的血管属于幼稚血管,结构和功能都不完善。如果阻断Ang-1和受体的结合可以发现新生血管内皮细胞和周围间质细胞缺乏紧密连接,血管分支不足且不能形成完整的管状结构 [3] 。对于成熟血管,血管周围细胞如成纤维细胞、血管平滑肌细胞等可以分泌一定量的Ang-1,吸引血管内皮细胞从而维持血管结构的稳定 [4] 。内皮细胞受损时或者分裂增加时,Ang-1的分泌可能增多进而促进新生血管向成熟化发展。阻断Ang-1基因时由于对内皮细胞没有趋化作用减弱可能是血管缺乏分支生长的原因之一。(2)新生血管形成的初期血管内皮细胞开始分裂、运动、相互融合成管状结构,随后周围间质细胞围绕血管内皮细胞构成完整的血管。Ang-1在体内的浓度变化将会影响到血管内皮细胞的运动和融合,因此Ang-1对血管内皮细胞的趋化作用可能对肿瘤、缺氧等病理情况下的新生血管形成起到一定的作用。但是趋化分析实验是体外的直接作用,体内的情况可能更为复杂而且影响因素更多。目前还不清楚Ang-1/Tie2表达增多的启动环节,有学者认为和VEGF一样,局部内环境的缺氧是引起这一变化的原因之一 [5] 。但其中的具体调控机制仍待进一步阐明。

    肿瘤细胞可以分泌多种生长因子,已有许多报道表明原发性肝癌时肿瘤局部和血液循环中VEGF的表达是增加的 [6] 。目前还不清楚肿瘤细胞中Anˉgiopoietin的表达情况,我们所用体外培养的SMMC7721肝癌细胞系用RT-PCR检测未发现Anˉgiopoietin的表达。但是体内肿瘤细胞与周围环境的作用远较体外培养的细胞要复杂得多,所以无法断定体内肝癌组织是否表达Angiopoietin。通过基因转染技术将Ang-1基因导入肝癌细胞使其表达相应蛋白产物后,SMMC7721肝癌细胞对脐静脉内皮细胞的趋化作用明显增强。是否说明体内的肝癌细胞如果表达Ang-1基因将会吸引更多的血管内皮细 胞从而有利于其侵袭和转移,虽然尚有待于进一步论证,但肝癌具有容易侵犯血管和经血道转移的特性,Ang-1可能在其中起到一定的作用。

    参考文献

    1 Davis S,Yancopoulos GD.The angiopoietins:Yin and Yang in angioˉgenesis.Curr Top Microbiol Immunol,1999,237(25):173-185.

    2 Shalaby F,Rossant J,Yamaguchi TP,et al.Failure of blood-island formation and vasculogenesis in Flk-1-deficient mice.Nature,1995,376(6535):62-66.

    3 SatoTN,Tozawa Y,DeutschU,et al.Distinct roles of the receptor tyroˉsine kinases Tie-1and Tie-2in blood vessel formation.Nature,1995,376(6535):70-74.

    4 Maisonpierre PC,Suri C,Jones PF,et al.Angiopoietin-2:a natural antagonist for Tie2that disrupts in vivo angiogenesis.Science,1997,277:55-60.

    5 Levy AP,Levy NS,Wegner S,et al.Transcriptional Regulation of the Rat Vascular Endothelial Growth Factor Gene by Hypoxia.J Biol Chem,1995,272(22):13333-13340.

    6 Anoka S,Mori M,Sakamoto Y,et al.Biologic significance of angiopoiˉetin-2expression in human hepatocellular carcinoma.J Clin Invest,1999,103(3):341-345.

    (收稿日期:2004-09-06)

    ˇ 基金项目:广东省医学科学研究基金(A2002042)

    作者单位:510080广东省人民医院肝胆外科

    (编辑江 风), http://www.100md.com(彭林 王卫东 孙建)