HPLC法测定炙甘草汤中甘草酸含量
http://www.100md.com
刘荣华 陈兰英 陈奇 毕明
关键词 炙甘草汤 甘草酸 HPLC法
炙甘草汤出自东汉张仲景的《伤寒论》，为治疗“心动悸、脉结代”的古代名方，现代用于抗心律失常[1]。炙甘草为本方的君药，其有效成分甘草酸具有明显的抗心律失常作用。本实验采用高效液相色谱法对此方汤剂中甘草酸进行了定量分析，为本方的复方制剂研究提供了实验依据。
1 仪器与试药
仪器：高效液相色谱仪(U.S.A)，Waters-510双泵，U6K进样器，996(PDA)检测器(U.S.A)，Millennium 2010 V2.0色谱管理系统。
药品：甘草酸单铵盐对照品(中国药品生物制品检定所)，甘草(购于内蒙，自炙)，红参(购于吉林省通化县)，川麦冬(购于四川省绵阳县)，生姜、生地、桂枝、阿胶、麻仁、大枣(购于江西中医学院专家门诊部)。药材均经本院中药鉴定教研室鉴定，符合《中国药典》标准。
, 百拇医药
样品溶液的制备：样品Ⅰ为炙甘草汤按传统工艺煎煮3次，合并煎煮液浓缩至100 mL/剂的浸膏；样品Ⅱ为炙甘草汤方去炙甘草后按样品Ⅰ制备法制成的100mL/剂的浸膏。
2 实验内容
2.1 色谱条件[2，3] 色谱柱：Nova-PaK C18 3.9 mm×150 mm,4.1μm。保护柱：C184.0μm。流动相：甲醇-水(70∶30)，用冰醋酸调至pH 5～6。流速1 mL/min，检测波长254 nm。
2.2 供试品溶液制备 精密称取样品Ⅰ约3g,用50%甲醇超声提取2次，每次30mL提取30min，合并提取液，离心，收集甲醇溶液。残渣用少量50%甲醇洗涤，合并甲醇溶液浓缩并定容至10mL。
2.3 阴性对照溶液制备 精密称取样品Ⅱ3g左右，照供试品溶液制备法制成10mL甲醇溶液。
, 百拇医药
2.4 炙甘草药材溶液制备 精密称取炙甘草药材粉末0.2908 g，照供试品溶液制备法制成10 mL甲醇溶液。
2.5 标准溶液制备 精密称取甘草酸单铵盐对照品2.312 mg，用甲醇定容于2 mL容量瓶中(浓度为1.156 g/L)。
2.6 干扰试验[4] 取缺甘草阴性对照溶液、供试品溶液、标准溶液及炙甘草药材溶液直接供HPLC进样，从HPLC图谱中可知，炙甘草汤中其它成分对甘草酸的测定结果无影响。
2.7 工作曲线 精密吸取甘草酸单铵盐标准溶液1，2，3，4，5，6，7 μL，按上述色谱条件测定出峰面积。求得回归方程为：R=748 438.229 7 A+240 498.913 3,r=0.999 8,线性范围 1.156～8.092 μg。
2.8 样品中甘草酸含量测定 精密吸取供试品溶液4 μL进样，按前述色谱条件测得3批炙甘草汤样品中平均每剂含甘草酸(0.406 7±0.018 5)g。
, 百拇医药
2.9 炙甘草药材中甘草酸含量测定[5] 精密吸取炙甘草药材溶液4μL进样，按样品测定法测得甘草酸含量为(3.961±0.031 1)%。
2.10 加样回收率实验 精密称取样品Ⅰ浸膏3 g左右3份，分别按不同比例加入甘草酸单铵盐标准溶液0.1，0.2，0.4μL，照供试品溶液制备法分别配制10 mL甲醇溶液，各取4μL进样，按样品测定法测得加样回收率分别为102.3%，103.3%和99.99%，平均为101.9%，RSD为1.698%。
2.11 重现性测定 将同一批号样品，按上述方法取样6份，测定结果=0.4018 g/剂，RSD为1.365%。
3 讨论
本实验3批样品均严格按处方要求投料，测得结果为平均每剂炙甘草汤含甘草酸0.406 7 g。同时测得炙甘草药材中甘草酸的含量为3.961%。按炙甘草汤方中炙甘草的投料量(每剂12 g)计算，炙甘草汤中甘草酸的平均含量较炙甘草药材降低了14.44%。据报道甘草分别与人参、麦冬、干姜煎煮后，测得甘草酸的含量低于单味药材中所测得的含量[6]。原因可能是在煎煮过程中产生了吸附或盐析等作用，也有可能药材配伍使化学成分发生变化。具体原因，还有待于进一步深入研究。
, 百拇医药
干扰试验中，炙甘草汤供试品的HPLC图谱在保留时间5.0～5.5 min处出现一小肩峰，原因是测定时流动相甲醇-水(70∶30)没有用冰醋酸调pH至5～6，测得流动相的pH值为7，经反复试验，用冰醋酸调pH至5～6后，肩峰可消失，在以后的含量测定实验中流动相pH值均为5～6。
作者单位：刘荣华 陈兰英 陈奇 毕明 (江西中医学院 南昌 330006)
参考文献
[1] 陈奇主编.中成药与名方药理及临床应用.香港：海天出版社，1991.299
[2] 李章万.离子对色谱与离子抑制色谱测定甘草酸含量的方法比较.药物分析杂志，1992，12(1)：15
[3] 赵淑杰.HPLC在中成药分析中的应用.中成药，1994，16(9)：45
, 百拇医药
[4] 李章万.甘草及其制剂中甘草酸含量的高效液相色谱测定法.华西药学杂志，1990，5(1)：19
[5] 刘世端.高效液相色谱法测定百合固金汤中芍药甙和甘草酸的含量.中成药，1992，14(3)：11
[6] 富森毅.甘草煎煮液中各配伍生药对甘草甜素含量的影响.生药学杂志，1980，34(2)：138
(收稿日期：1998-11-20)
江西中医学院学报
JOURNAL OF JIANGXI COLLEGE OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE
1999年 第11卷 第1期 Vol.11 No.1 1999, http://www.100md.com
关键词 炙甘草汤 甘草酸 HPLC法
炙甘草汤出自东汉张仲景的《伤寒论》，为治疗“心动悸、脉结代”的古代名方，现代用于抗心律失常[1]。炙甘草为本方的君药，其有效成分甘草酸具有明显的抗心律失常作用。本实验采用高效液相色谱法对此方汤剂中甘草酸进行了定量分析，为本方的复方制剂研究提供了实验依据。
1 仪器与试药
仪器：高效液相色谱仪(U.S.A)，Waters-510双泵，U6K进样器，996(PDA)检测器(U.S.A)，Millennium 2010 V2.0色谱管理系统。
药品：甘草酸单铵盐对照品(中国药品生物制品检定所)，甘草(购于内蒙，自炙)，红参(购于吉林省通化县)，川麦冬(购于四川省绵阳县)，生姜、生地、桂枝、阿胶、麻仁、大枣(购于江西中医学院专家门诊部)。药材均经本院中药鉴定教研室鉴定，符合《中国药典》标准。
, 百拇医药
样品溶液的制备：样品Ⅰ为炙甘草汤按传统工艺煎煮3次，合并煎煮液浓缩至100 mL/剂的浸膏；样品Ⅱ为炙甘草汤方去炙甘草后按样品Ⅰ制备法制成的100mL/剂的浸膏。
2 实验内容
2.1 色谱条件[2，3] 色谱柱：Nova-PaK C18 3.9 mm×150 mm,4.1μm。保护柱：C184.0μm。流动相：甲醇-水(70∶30)，用冰醋酸调至pH 5～6。流速1 mL/min，检测波长254 nm。
2.2 供试品溶液制备 精密称取样品Ⅰ约3g,用50%甲醇超声提取2次，每次30mL提取30min，合并提取液，离心，收集甲醇溶液。残渣用少量50%甲醇洗涤，合并甲醇溶液浓缩并定容至10mL。
2.3 阴性对照溶液制备 精密称取样品Ⅱ3g左右，照供试品溶液制备法制成10mL甲醇溶液。
, 百拇医药
2.4 炙甘草药材溶液制备 精密称取炙甘草药材粉末0.2908 g，照供试品溶液制备法制成10 mL甲醇溶液。
2.5 标准溶液制备 精密称取甘草酸单铵盐对照品2.312 mg，用甲醇定容于2 mL容量瓶中(浓度为1.156 g/L)。
2.6 干扰试验[4] 取缺甘草阴性对照溶液、供试品溶液、标准溶液及炙甘草药材溶液直接供HPLC进样，从HPLC图谱中可知，炙甘草汤中其它成分对甘草酸的测定结果无影响。
2.7 工作曲线 精密吸取甘草酸单铵盐标准溶液1，2，3，4，5，6，7 μL，按上述色谱条件测定出峰面积。求得回归方程为：R=748 438.229 7 A+240 498.913 3,r=0.999 8,线性范围 1.156～8.092 μg。
2.8 样品中甘草酸含量测定 精密吸取供试品溶液4 μL进样，按前述色谱条件测得3批炙甘草汤样品中平均每剂含甘草酸(0.406 7±0.018 5)g。
, 百拇医药
2.9 炙甘草药材中甘草酸含量测定[5] 精密吸取炙甘草药材溶液4μL进样，按样品测定法测得甘草酸含量为(3.961±0.031 1)%。
2.10 加样回收率实验 精密称取样品Ⅰ浸膏3 g左右3份，分别按不同比例加入甘草酸单铵盐标准溶液0.1，0.2，0.4μL，照供试品溶液制备法分别配制10 mL甲醇溶液，各取4μL进样，按样品测定法测得加样回收率分别为102.3%，103.3%和99.99%，平均为101.9%，RSD为1.698%。
2.11 重现性测定 将同一批号样品，按上述方法取样6份，测定结果=0.4018 g/剂，RSD为1.365%。
3 讨论
本实验3批样品均严格按处方要求投料，测得结果为平均每剂炙甘草汤含甘草酸0.406 7 g。同时测得炙甘草药材中甘草酸的含量为3.961%。按炙甘草汤方中炙甘草的投料量(每剂12 g)计算，炙甘草汤中甘草酸的平均含量较炙甘草药材降低了14.44%。据报道甘草分别与人参、麦冬、干姜煎煮后，测得甘草酸的含量低于单味药材中所测得的含量[6]。原因可能是在煎煮过程中产生了吸附或盐析等作用，也有可能药材配伍使化学成分发生变化。具体原因，还有待于进一步深入研究。
, 百拇医药
干扰试验中，炙甘草汤供试品的HPLC图谱在保留时间5.0～5.5 min处出现一小肩峰，原因是测定时流动相甲醇-水(70∶30)没有用冰醋酸调pH至5～6，测得流动相的pH值为7，经反复试验，用冰醋酸调pH至5～6后，肩峰可消失，在以后的含量测定实验中流动相pH值均为5～6。
作者单位：刘荣华 陈兰英 陈奇 毕明 (江西中医学院 南昌 330006)
参考文献
[1] 陈奇主编.中成药与名方药理及临床应用.香港：海天出版社，1991.299
[2] 李章万.离子对色谱与离子抑制色谱测定甘草酸含量的方法比较.药物分析杂志，1992，12(1)：15
[3] 赵淑杰.HPLC在中成药分析中的应用.中成药，1994，16(9)：45
, 百拇医药
[4] 李章万.甘草及其制剂中甘草酸含量的高效液相色谱测定法.华西药学杂志，1990，5(1)：19
[5] 刘世端.高效液相色谱法测定百合固金汤中芍药甙和甘草酸的含量.中成药，1992，14(3)：11
[6] 富森毅.甘草煎煮液中各配伍生药对甘草甜素含量的影响.生药学杂志，1980，34(2)：138
(收稿日期：1998-11-20)
江西中医学院学报
JOURNAL OF JIANGXI COLLEGE OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE
1999年 第11卷 第1期 Vol.11 No.1 1999, http://www.100md.com