中药对家兔实验性膝关节骨性关节炎氧自由基代谢的影响
http://www.100md.com
陕西省西安市红十字会医院(710054)
马建兵 刘德玉1 李堪印1 沙浩渡 孟祥东
提要 为探讨中药对骨性关节炎氧自由基代谢的影响，采用Hulth方法复制出家兔膝骨关节炎模型并随机分为模型组、芬必得组和中药逐痹汤组。均于治疗1个月后测定红细胞超氧化物歧化酶(SOD)活性及血清脂质过氧化物(LPO)含量，并做统计学分析。结果显示逐痹汤组动物的SOD活性显著高于其他两组，而LPO含量显著低于其他两组(P<0.01)，模型组与芬必得组无显著性差异(P>0.05)。认为逐痹汤可显著提高SOD的活性，降低LPO含量，从而起到延缓关节软骨的退变，促进软骨修复的作用。
主题词 膝关节骨性关节炎/中医药疗法 氧自由基代谢/药物作用 实验研究 动物 兔
, 百拇医药
中图分类号：R289·5；R648·3 文献标识码：A 文章编号：1001-6015(2000)-0008-02
作者简介 马建兵，男，1973年11月生。1998年毕业于陕西中医学院中西医结合骨伤专业，获硕士学位。现在西安市红十字会医院创伤骨科工作。主要从事创伤骨折、软组织损伤及骨病等的临床研究。
1 陕西中医学院附属医院
骨性关节炎(osteoarthritis，OA)是一种慢性退行性关节疾病，关节软骨的退变是其发病 的根本原因。随着社会人口老龄化，OA的发生越来越多。对于OA的治疗以往多局限于对症治疗，包括目前所用的透明质酸酶等药物均未能从根本上解决问题。本实验以临床疗效确切的陕西中医学院经验方逐痹汤治疗家兔实验性膝骨关节炎，并以芬必得对照，探讨中医药延缓和修复关节软骨退变的作用机理，为OA的治疗提供参考。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 实验动物 健康雄性家兔36只，体重2.5～3.5kg。根据随机原则分为模型组、芬必得组和逐痹汤组，各组分别为12只。后两组每只每日分别灌服15ml药液，模型组灌服等量生理盐水。
1.2 药品及试剂 (1)逐痹汤：由熟地、生黄芪、白芍、苍术、黄柏、肉苁蓉、三七、生薏苡仁、当归、秦艽、牛膝、甘草组成，配制成每毫升含生药量1g的浓缩液。(2)芬必得胶囊：市售中美天津史克制药有限公司生产，批号97020592，以纯蒸馏水制成4mg·ml-1浓度的混悬液。
1.3 动物模型 参考Hulth造模方法，将动物用硫喷妥钠30mg·kg-1剂量耳缘静脉麻醉，仰卧绑于手术台上固定，取右膝关节内侧纵切口长约4cm，探查关节腔无原发病变后仔细切断前后交叉韧带，切断内侧副韧带，完整切除内侧半月板(勿损伤关节软骨面)，逐层缝合伤口，无菌敷料包扎固定。术后每天肌肉注射青霉素20万单位，连续7天，以预防感染。
, 百拇医药
1.4 检测方法 (1)SOD活性检测：取肝素抗凝血5ml，用生理盐水冲洗2次，加双蒸水0.4ml充分溶血，依次加95%冷乙醇0.2ml、氯仿0.2ml混均匀，置于旋转混合器上振荡提取1分钟，转速每分钟3000r，离心5分钟沉淀血红蛋白，所取上清液即为SOD提取液，记录体积，按邻苯三酚法测定。(2)LPO含量检测：取血浆5ml，用磷钨酸沉淀加硫代巴比妥酸，按八木国夫的TBA荧光法沉淀血浆LPO的含量。
1.5 统计学处理方法 所有实验数据均采用统计学方法处理。均值间差异比较采用t检验，数据统计均以平均值±标准差(±s)表示，以P<0.05，P<0.001为显著水平。
2 实验结果
术后家兔均存在不同程度跛行，患肢不愿活动，为使实验结果更快捷准确，根据临床上超疲劳活动容易提前出现骨性关节炎的发病特点[1]，采用一笼一兔喂养方式每日强迫家兔活动30分钟。
, 百拇医药
2.1 SOD活性 逐痹汤组与芬必得组和模型组相比较具有显著性差异(P<0.01，P<0.001)，而模型组与芬必得组相比较无统计学意义(P>0.05)。
2.2 LPO含量 逐痹汤与芬必得组比较具有显著性差异(P<0.05)，与模型组比较有在极显著性差异(P<0.01)，而模型组与芬必得组相比较无统计学意义(P>0.05)。
3 讨 论
3.1 关于动物模型 考虑到OA系多种病因导致的关节经久应力不匀而发生的关节软骨的退行性变和继发性骨质增生这一发病特点，本实验采用Hulth造模方法，手术切断家兔膝关节前后交叉韧带及内侧副韧带，完整切除内侧半月板，破坏了家兔膝关节正常的力学轴线，使膝关节的应力轴线由正常的外翻10°变为内翻，关节最大压应力由正常的外侧胫骨平台转移到内侧胫骨平台与股骨内髁关节承担，关节的负重面减少，局部关节软骨所承受的压应力相对增加，再加上韧带的破坏，加重了关节的不稳定性，从而形成了关节软骨变性的起始环节[2]。Michae[3]曾研究了关节软骨变性过程中的生化成分的改变，发现关节长期力学改变，可使关节软骨承受间歇性压力的主要成分糖蛋白逐渐减少，软骨脱水，胶原纤维暴露，从而引起关节软骨退变。这种造模方法基本符合临床OA的发生机理。模型组的病理改变结果验证了Hulth造模方法是可行的。
, 百拇医药
3.2 中国传统医学对OA的认识及组方依据 中国传统医学认为本病以肝肾亏虚为基础，以闪挫跌仆及感受外邪为诱因。肝主筋，肾主骨，筋附骨，中年以后肝血肾精渐亏，肝虚无以养筋，肾虚无以主骨，精血不足无以濡养筋骨，再加风寒湿邪或跌仆闪挫诱发致使气血瘀滞，痰湿不行，经脉痹阻，日久则脉络失和，肝肾两亏。本方重用熟地，取其甘温，守而不走，补益肝肾为君药；肉苁蓉补肾暖腰，牛膝祛风寒，强腰膝，助熟地滋补肝肾，填精益髓，合黄芪、当归、白芍三药大补气血共为臣药：以生薏苡仁、秦艽、苍术、黄柏祛风湿止痹痛，合三七活血化淤通行气血共为佐药；甘草益气和中调和诸药为使。诸药合用，共奏补肝肾、益气血、祛风湿、止痹痛之功效。
3.3 逐痹汤对氧自由基的影响 本实验证实，逐痹汤可显著提高自由基清除剂SOD的活性，并显著降低脂质过氧化反应LPO的含量，从而避免了氧自由基及其代谢产物对局部的损害。氧自由基是指在参与各种生物代谢过程中未被完全还原而产生的一系列不稳定的原子、离子、原子团和分子。他们外层电子轨道有不配对电子，性质极其活跃。在正常生理情况下，由于机体具有强大的自由基防御系统可将机体代谢所产生的自由基及时清除。但在病理情况下，自由基的生成增加，清除率下降而导致自由基堆积，继而自由基作用于多不饱和脂肪酸(PUFA)而诱发脂质过氧化反应，脂质过氧化物(LPO)增加，通过多种途径对局部组织产生破坏[4]。
, 百拇医药
OA患者关节、滑膜、滑液中常有中性白细胞及巨噬细胞聚集，当他们表面受到免疫复合物、补体成分等作用时，可释放大量自由基，如超氧阴离子自由基等，很容易形成活泼的羟自由基(OH-)，目前已有很多实验证实该类自由基是引起关节软骨退变及关节滑液改变的重要原因[5,6]。其机理如下：
OA患者体内有较多的退变坏死的碎屑，为处理这些碎屑大量多形核白细胞(PMNS)进入关节，由于特殊代谢刺激物的刺激使其代谢被激活产生大量的氧自由基，一方面破坏正常软骨细胞，另一方面又侵害PMNS本身造成软骨进一步损害[7]。氧自由基诱发的脂质过氧化反应使基质中胶原纤维发生交联，形成大分子物质，而使胶原蛋白僵硬失去弹性[8]。逐痹汤正是通过提高自由基清除剂超氧化物歧化酶(SOD)的活性而起到清除机体多余自由基，抑制氧自由基对软骨细胞及基质的损害作用，同时能显著降低脂质过氧化反应的产物LPO的含量，防止继发性损害，从而起到保护软骨及其基质免受氧自由基侵害的作用，进而延缓关节软骨的退变。
, 百拇医药 4 参考文献
1 Milgram JW.Morphologic alterations of the subchondral bone in advanced degenerative arthritis.Clinical Orthopaedics and Pelated Research1983；173：293
2 沈霖，杨家玉，高兰，等。兔膝关节骨关节病模型的复制及健骨汤对其的治疗作用。中医研究 1992；5(6)：18
2 Michael GE,Lambotte A,Woo S LY， et al.Biochemical confirmation of an experimental osteoarthritis model.J Bone and Joint Surg 1975；57(a)：39
3 Greenwald RA ,Inhibition of collagen by action of the supertoxide tadical. Arthritis Rheum 1979；22：251
, 百拇医药
5 Bates Rheum,Boehler L,Schatzker J,et al. Oxygen freeradicals mediate an inhibition of proteoglycan synthesis in cartilage. Annals of Rheumatic Diseases 1984；43：462
6 Bukhadt H,Segmuller G.Ruedi T,et al.Oxygen radicals as effector of cartilage destruction. Arthritis Rheum 1986；29：379
7 谢林，周尊谦，孙达武。丹紫康冲剂对膝关节退行性骨关节病患者氧自由基代谢的影响。中国中医骨伤科 1998；4(2)：8：8
(1999-05-23收稿 1999-09-06修回)
《中医正骨》, 百拇医药
马建兵 刘德玉1 李堪印1 沙浩渡 孟祥东
提要 为探讨中药对骨性关节炎氧自由基代谢的影响，采用Hulth方法复制出家兔膝骨关节炎模型并随机分为模型组、芬必得组和中药逐痹汤组。均于治疗1个月后测定红细胞超氧化物歧化酶(SOD)活性及血清脂质过氧化物(LPO)含量，并做统计学分析。结果显示逐痹汤组动物的SOD活性显著高于其他两组，而LPO含量显著低于其他两组(P<0.01)，模型组与芬必得组无显著性差异(P>0.05)。认为逐痹汤可显著提高SOD的活性，降低LPO含量，从而起到延缓关节软骨的退变，促进软骨修复的作用。
主题词 膝关节骨性关节炎/中医药疗法 氧自由基代谢/药物作用 实验研究 动物 兔
, 百拇医药
中图分类号：R289·5；R648·3 文献标识码：A 文章编号：1001-6015(2000)-0008-02
作者简介 马建兵，男，1973年11月生。1998年毕业于陕西中医学院中西医结合骨伤专业，获硕士学位。现在西安市红十字会医院创伤骨科工作。主要从事创伤骨折、软组织损伤及骨病等的临床研究。
1 陕西中医学院附属医院
骨性关节炎(osteoarthritis，OA)是一种慢性退行性关节疾病，关节软骨的退变是其发病 的根本原因。随着社会人口老龄化，OA的发生越来越多。对于OA的治疗以往多局限于对症治疗，包括目前所用的透明质酸酶等药物均未能从根本上解决问题。本实验以临床疗效确切的陕西中医学院经验方逐痹汤治疗家兔实验性膝骨关节炎，并以芬必得对照，探讨中医药延缓和修复关节软骨退变的作用机理，为OA的治疗提供参考。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 实验动物 健康雄性家兔36只，体重2.5～3.5kg。根据随机原则分为模型组、芬必得组和逐痹汤组，各组分别为12只。后两组每只每日分别灌服15ml药液，模型组灌服等量生理盐水。
1.2 药品及试剂 (1)逐痹汤：由熟地、生黄芪、白芍、苍术、黄柏、肉苁蓉、三七、生薏苡仁、当归、秦艽、牛膝、甘草组成，配制成每毫升含生药量1g的浓缩液。(2)芬必得胶囊：市售中美天津史克制药有限公司生产，批号97020592，以纯蒸馏水制成4mg·ml-1浓度的混悬液。
1.3 动物模型 参考Hulth造模方法，将动物用硫喷妥钠30mg·kg-1剂量耳缘静脉麻醉，仰卧绑于手术台上固定，取右膝关节内侧纵切口长约4cm，探查关节腔无原发病变后仔细切断前后交叉韧带，切断内侧副韧带，完整切除内侧半月板(勿损伤关节软骨面)，逐层缝合伤口，无菌敷料包扎固定。术后每天肌肉注射青霉素20万单位，连续7天，以预防感染。
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1.4 检测方法 (1)SOD活性检测：取肝素抗凝血5ml，用生理盐水冲洗2次，加双蒸水0.4ml充分溶血，依次加95%冷乙醇0.2ml、氯仿0.2ml混均匀，置于旋转混合器上振荡提取1分钟，转速每分钟3000r，离心5分钟沉淀血红蛋白，所取上清液即为SOD提取液，记录体积，按邻苯三酚法测定。(2)LPO含量检测：取血浆5ml，用磷钨酸沉淀加硫代巴比妥酸，按八木国夫的TBA荧光法沉淀血浆LPO的含量。
1.5 统计学处理方法 所有实验数据均采用统计学方法处理。均值间差异比较采用t检验，数据统计均以平均值±标准差(±s)表示，以P<0.05，P<0.001为显著水平。
2 实验结果
术后家兔均存在不同程度跛行，患肢不愿活动，为使实验结果更快捷准确，根据临床上超疲劳活动容易提前出现骨性关节炎的发病特点[1]，采用一笼一兔喂养方式每日强迫家兔活动30分钟。
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2.1 SOD活性 逐痹汤组与芬必得组和模型组相比较具有显著性差异(P<0.01，P<0.001)，而模型组与芬必得组相比较无统计学意义(P>0.05)。
2.2 LPO含量 逐痹汤与芬必得组比较具有显著性差异(P<0.05)，与模型组比较有在极显著性差异(P<0.01)，而模型组与芬必得组相比较无统计学意义(P>0.05)。
3 讨 论
3.1 关于动物模型 考虑到OA系多种病因导致的关节经久应力不匀而发生的关节软骨的退行性变和继发性骨质增生这一发病特点，本实验采用Hulth造模方法，手术切断家兔膝关节前后交叉韧带及内侧副韧带，完整切除内侧半月板，破坏了家兔膝关节正常的力学轴线，使膝关节的应力轴线由正常的外翻10°变为内翻，关节最大压应力由正常的外侧胫骨平台转移到内侧胫骨平台与股骨内髁关节承担，关节的负重面减少，局部关节软骨所承受的压应力相对增加，再加上韧带的破坏，加重了关节的不稳定性，从而形成了关节软骨变性的起始环节[2]。Michae[3]曾研究了关节软骨变性过程中的生化成分的改变，发现关节长期力学改变，可使关节软骨承受间歇性压力的主要成分糖蛋白逐渐减少，软骨脱水，胶原纤维暴露，从而引起关节软骨退变。这种造模方法基本符合临床OA的发生机理。模型组的病理改变结果验证了Hulth造模方法是可行的。
, 百拇医药
3.2 中国传统医学对OA的认识及组方依据 中国传统医学认为本病以肝肾亏虚为基础，以闪挫跌仆及感受外邪为诱因。肝主筋，肾主骨，筋附骨，中年以后肝血肾精渐亏，肝虚无以养筋，肾虚无以主骨，精血不足无以濡养筋骨，再加风寒湿邪或跌仆闪挫诱发致使气血瘀滞，痰湿不行，经脉痹阻，日久则脉络失和，肝肾两亏。本方重用熟地，取其甘温，守而不走，补益肝肾为君药；肉苁蓉补肾暖腰，牛膝祛风寒，强腰膝，助熟地滋补肝肾，填精益髓，合黄芪、当归、白芍三药大补气血共为臣药：以生薏苡仁、秦艽、苍术、黄柏祛风湿止痹痛，合三七活血化淤通行气血共为佐药；甘草益气和中调和诸药为使。诸药合用，共奏补肝肾、益气血、祛风湿、止痹痛之功效。
3.3 逐痹汤对氧自由基的影响 本实验证实，逐痹汤可显著提高自由基清除剂SOD的活性，并显著降低脂质过氧化反应LPO的含量，从而避免了氧自由基及其代谢产物对局部的损害。氧自由基是指在参与各种生物代谢过程中未被完全还原而产生的一系列不稳定的原子、离子、原子团和分子。他们外层电子轨道有不配对电子，性质极其活跃。在正常生理情况下，由于机体具有强大的自由基防御系统可将机体代谢所产生的自由基及时清除。但在病理情况下，自由基的生成增加，清除率下降而导致自由基堆积，继而自由基作用于多不饱和脂肪酸(PUFA)而诱发脂质过氧化反应，脂质过氧化物(LPO)增加，通过多种途径对局部组织产生破坏[4]。
, 百拇医药
OA患者关节、滑膜、滑液中常有中性白细胞及巨噬细胞聚集，当他们表面受到免疫复合物、补体成分等作用时，可释放大量自由基，如超氧阴离子自由基等，很容易形成活泼的羟自由基(OH-)，目前已有很多实验证实该类自由基是引起关节软骨退变及关节滑液改变的重要原因[5,6]。其机理如下：
OA患者体内有较多的退变坏死的碎屑，为处理这些碎屑大量多形核白细胞(PMNS)进入关节，由于特殊代谢刺激物的刺激使其代谢被激活产生大量的氧自由基，一方面破坏正常软骨细胞，另一方面又侵害PMNS本身造成软骨进一步损害[7]。氧自由基诱发的脂质过氧化反应使基质中胶原纤维发生交联，形成大分子物质，而使胶原蛋白僵硬失去弹性[8]。逐痹汤正是通过提高自由基清除剂超氧化物歧化酶(SOD)的活性而起到清除机体多余自由基，抑制氧自由基对软骨细胞及基质的损害作用，同时能显著降低脂质过氧化反应的产物LPO的含量，防止继发性损害，从而起到保护软骨及其基质免受氧自由基侵害的作用，进而延缓关节软骨的退变。
, 百拇医药 4 参考文献
1 Milgram JW.Morphologic alterations of the subchondral bone in advanced degenerative arthritis.Clinical Orthopaedics and Pelated Research1983；173：293
2 沈霖，杨家玉，高兰，等。兔膝关节骨关节病模型的复制及健骨汤对其的治疗作用。中医研究 1992；5(6)：18
2 Michael GE,Lambotte A,Woo S LY， et al.Biochemical confirmation of an experimental osteoarthritis model.J Bone and Joint Surg 1975；57(a)：39
3 Greenwald RA ,Inhibition of collagen by action of the supertoxide tadical. Arthritis Rheum 1979；22：251
, 百拇医药
5 Bates Rheum,Boehler L,Schatzker J,et al. Oxygen freeradicals mediate an inhibition of proteoglycan synthesis in cartilage. Annals of Rheumatic Diseases 1984；43：462
6 Bukhadt H,Segmuller G.Ruedi T,et al.Oxygen radicals as effector of cartilage destruction. Arthritis Rheum 1986；29：379
7 谢林，周尊谦，孙达武。丹紫康冲剂对膝关节退行性骨关节病患者氧自由基代谢的影响。中国中医骨伤科 1998；4(2)：8：8
(1999-05-23收稿 1999-09-06修回)
《中医正骨》, 百拇医药