hHGF-αcDNA的克隆及表达载体的构建
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党素英；程牛亮；牛勃；王惠珍；赵建滨；张祖珣
肝细胞生长因子|DNA|互补|克隆|基因,关键词：
参见附件(56kb)。
党素英；程牛亮；牛勃；王惠珍；赵建滨；张祖珣 山西医科大学生物化学与分子生物学教研室；太原030001；首都医科大学生物化学教研室 山西医科大学学报 2001 2
关键词：肝细胞生长因子；DNA；互补；克隆；基因
目的 定点突变法扩增制备完整hHGF αcDNA,克隆并构建其原核表达载体。方法与结果 以含有人HGFcDNA全序列的质粒pRC/CMV hHGF为模板,设计合成一对特异引物进行聚合酶链反应(PCR),扩增hHGF αcDNA基因,琼脂糖凝胶电泳检测,结果显示扩增得到了1 34kb长的目的基因产物。将扩增产物以限制性内切酶XhoⅠ酶将其切为386bp、954bp两个片段,分别以EcoRⅠ/XhoⅠ、XhoⅠ/BamHⅠ与pBSKS载体连接重组,对目的基因分段克隆后进行序列测定,结果表明除通过定点突变引入的起始密码ATG、终止密码子TAA、TGA及EcoRⅠ、BamHⅠ识别位点外,扩增得到的PCR产物序列与Nakamura等报道的HGFcDNA中不包括前体序列的α链部分完全相同。将以EcoRⅠ/XhoⅠ、XhoⅠ/BamHⅠ从pBSKS HGF α386、pBSKS HGF α954中切出的386bp、954bp两个片段以EcoRⅠ/BamHⅠ与pBV220连接构建重组表达质粒pBV220 HGF α,限制性内切酶图谱分析显示HGF αcDNA插入到载体pBV220的EcoRⅠ/BamHⅠ位点,插入方向正确。温度诱导表达,SDS PAGE显示一分子量与单体hHGF α链吻合的蛋白带,证明表达质粒构建成功。结论 设计制备了hHGF α链cDNA,克隆建立了hHGF α链原核表达质粒。
关键词：肝细胞生长因子；DNA；互补；克隆；基因
目的 定点突变法扩增制备完整hHGF αcDNA,克隆并构建其原核表达载体。方法与结果 以含有人HGFcDNA全序列的质粒pRC/CMV hHGF为模板,设计合成一对特异引物进行聚合酶链反应(PCR),扩增hHGF αcDNA基因,琼脂糖凝胶电泳检测,结果显示扩增得到了1 34kb长的目的基因产物。将扩增产物以限制性内切酶XhoⅠ酶将其切为386bp、954bp两个片段,分别以EcoRⅠ/XhoⅠ、XhoⅠ/BamHⅠ与pBSKS载体连接重组,对目的基因分段克隆后进行序列测定,结果表明除通过定点突变引入的起始密码ATG、终止密码子TAA、TGA及EcoRⅠ、BamHⅠ识别位点外,扩增得到的PCR产物序列与Nakamura等报道的HGFcDNA中不包括前体序列的α链部分完全相同。将以EcoRⅠ/XhoⅠ、XhoⅠ/BamHⅠ从pBSKS HGF α386、pBSKS HGF α954中切出的386bp、954bp两个片段以EcoRⅠ/BamHⅠ与pBV220连接构建重组表达质粒pBV220 HGF α,限制性内切酶图谱分析显示HGF αcDNA插入到载体pBV220的EcoRⅠ/BamHⅠ位点,插入方向正确。温度诱导表达,SDS PAGE显示一分子量与单体hHGF α链吻合的蛋白带,证明表达质粒构建成功。结论 设计制备了hHGF α链cDNA,克隆建立了hHGF α链原核表达质粒。
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