关键词：胰岛素；局灶脑缺血；c-fos基因；c-jun基因
摘 要： 目的 观察胰岛素对局灶缺血性脑组织c-fos、c-jun基因表达的影响。方法 30只肾血管性高血压大鼠随机分4组，在大脑中动脉闭塞(MCAO)后即予胰岛素(2.1IU/kg，A组)、葡萄糖和胰岛素(2.1 IU/kg,B组；4.5IU/kg,C组)、生理盐水(D组)，采用原位杂交技术检测各组MCAO后3h脑组织c-fos、c-jun基因的表达。结果 与其它组比较，A组血糖下降明显(P<0.01),MCAO后1h、2h、3h分别为3.80±0.3mmol/L、3.68±0.3mmol/L、3.69±0.3mmol/L。c-fosmRNA被诱导出现于缺血侧皮层和尾壳核，C组c-fos mRNA明显增加(P<0.01)，皮层和尾壳核的灰度为123.58±8.72、141.08±8.49;c-junmRNA 仅出现于缺血侧皮层，A、B、C组的c-jun mRNA均增加明显，灰度分别为171.82±7.33、172.56±7.91、155.09±7.91，其中C组的增加更为显著(P<0.01)。结论 胰岛素促进缺血脑组织c-fos、c-jun基因表达可能是其神经保护作用机制之一。
中图分类号: R977.1;R743 文献标识码: A
文章编号: 1003-2754(2000)03-0144-03
Insulineffect on c-fos and c-jun gene expression in focal ischemic rat brain
WANGYi-dong,HUANG Ru-xun,LI Ling,et al.
(Department of Neurology,Sun Yat Sen Memorial Hospital,Sun Yat Sen University of MedicalScience,Guangzhou 510120,China)
Abstract ： Objective To investigate the effect of insulin on c-fos and c-jun geneexpression in focal ischemic rat brain. Methods The renovascular hypertensive rats (n=30) were divided at randominto 4 groups which received separately with insulin only (Group A,2.1 IU/kg),insulin andglucose (Group B with low dose insulin,2.1 IU/kg;Group C with high dose insulin,4.5IU/kg)or normal saline(Group D)immediately after middle cerebral artery occlusion (MCAO).Level of c-fos mRNA and c-jun mRNA on brain sections was measured by in situ hybridizationat 3h after MCAO. Results Bloodglucose level in group A was 3.80±0.3,3.68±0.3 and 3.69±0.3mmol/L at 1,2 and 3 hoursfollowing MCAO,which was lower than in the other groups(P<0.01). In ipsilateral cortexand caudoputamen after MCAO,c-fos mRNA significantly increased only in group C(P<0.01)and c-fos mRNA greg was 123.58±8.72 and 141.08±8.49. A significant increase in c-junmRNA in ipsilateral cortex was detected in Group A,B and C,and the strongest experssionwas seen in Group C(P<0.01). c-jun mRNA greg in Group A,B and C was 171.82±7.33、172.56±7.91 and 155.09±7.91. Conclusions These results indicate that the effect of insulin on c-fos andc-jun expression may be one of the mechanisms of neuroprotection of insulin.
Key words ： Insulin; Focalcerebral ischemia; c-fos; c-jun
大量资料显示胰岛素能减轻脑缺血损害，该作用并不完全依赖于胰岛素的降血糖效应[1，2] ，但其机制还不清楚。本研究选用具有慢性高血压、脑血管病变基础的肾血管性高血压大鼠(RHR)复制的大脑中动脉闭塞(MCAO)模型，在缺血后给予胰岛素，采用原位杂交(ISH)技术观察脑组织c-fos、c-jun基因表达的变化，以探讨胰岛素的神经保护机制。
1 材料与方法
1.1 动物模型的复制 选用体重80～120g的健康雄性封闭群Sprague-Dewley大鼠(购自广东省医用动物场)，行双肾双夹肾动脉狭窄术[3] 复制成肾血管性高血压大鼠(RHR)。高血压持续10周以上、血压达24kPa或以上、从未出现脑卒中症状的RHR30只再采用改进的Longa氏线栓法[4] 制备成MCAO模型。
1.2 实验分组与处理 符合MCAO模型复制条件的RHR 30只，不禁食，随机分4组：A组8只，MCAO后即予胰岛素2.1IU/kg(RI与NPH以1∶2比例分别腹腔注射ip和皮下注射)，保持血糖于3～4.5mmol/L;B组8只，MCAO后即予胰岛素(剂量和用法同A组)，同时予葡萄糖约2g/kg(50%GSip),保护血糖于正常范围(4.6～10mmol/L);C组，处理同B组，仅剂量增加为胰岛素4.5IU/kg，葡萄糖约4g/kg，血糖保持于正常范围；D组(对照组)6只，MCAO后仅予生理盐水4ml/kgip。胰岛素和葡萄糖剂量参考国外文献并进行了摸索。各组于术前30min、MCAO后1h、2h、3h取尾血用微量血糖计(Bayer,德国)测血糖，MCAO前后30min分别测血压(尾筒法[3] )、直肠温度(温度指示仪，上海医用仪表厂)、血气(pH、 PCO2 、 PO2 ， 尾动脉取血 0.4ml送检)。
1.3 c-fos mRNA、c-jun mRNA显示与测量 采用c-fos DNA探针(1.3kb,购自北京中山生物技术有限公司)、c-junDNA探针(2.0kb,购自北京天象人生物工程有限责任公司)，地高辛(DIG)标记(DIGDNA标记和检测试剂盒，Cat，购自德国Boehringer Mannheim公司)。各组大鼠在MCAO后3h时处死，迅速断头取脑，尽快冰冻切片，取经前连合冠状切片(5μm)行原位杂交。杂交过程参照BoehringerMannheim公司说明。设空白对照实验。杂交后切片进行图像分析(德国KontronIBAS 2.0全自动图像分析系统)，测定c-fos mRNA、c-jun mRNA平均灰度。
1.4 组织病理观察 取与原位杂交切片相邻的切片行HE染色，光镜下观察缺血区组织病理改变。
1.5 统计学处理 所有测量值以χ±s表示，各组间进行比较，方差齐者做方差分析，方差不齐者做秩和检验。
2 结 果
2.1 生理指标测量结果 各组血糖值见表1。A组在注射胰岛素后1 h 血糖即下降明显 ( P < 0.01)；B、C组虽然使用胰岛素，但由于同时注射相应剂量的葡萄糖，使血糖保持于正常范围。血压、直肠温度、血气等生理指标结果(略)，同一指标各组间比较，P值均>0.05。
表1 4组RHR血糖测量值
| 组别 | 只数 | 血糖(mmol/L) | |||
| MCAO前 30min | MCAO后 1h | MCAO后 2h | MCAO后 3h | ||
| A B C D | 8 8 8 6 | 6.06±0.5 6.06±0.4 6.05±0.4 6.14±0.6 | 3.80±0.3* 7.11±1.1 7.27±1.1 7.12±1.0 | 3.68±0.3* 7.21±1.1 6.99±1.1 7.07±1.0 | 3.69±0.3* 6.74±0.9 6.56±1.2 6.74±0.7 |
与其它组比* P<0.01
2.2 c-fos、c-jun表达部位和程度 MCAO后3h，c-fosmRNA、c-jun mRNA被诱导出现于缺血侧广泛大脑皮层(包括主要由大脑前动脉供血的扣带皮层)，c-fosmRNA还出现于缺血侧的尾壳核，尾壳核外侧的表达非常少，呈紫蓝色。测得的c-fos、c-junmRNA的平均灰度见表2。灰度越小，表示mRNA的量越大。与其它组比较，C组c-fosmRNA有显著增加(P<0.01),A、B、D组间c-fos mRNA无差异；与D组比较，A、B、C组的c-junmRNA均有增加，其中C组的增加更为显著(P<0.01),A、B组间则无差异。
表2 RHR MCAO后3h缺血侧脑组织c-fos、c-junmRNA平均灰度
| 组别 | 只数 | c-fos mRNA | c-jun mRNA 皮层 | |
| 皮层 | 尾壳核 | |||
| A B C D | 8 8 8 6 | 144.51±10.76 144.25±9.73 123.58±8.72** 154.12±8.94 | 161.88±10.44 162.49±10.90 141.08±8.49** 171.78±8.27 | 171.82±7.33* 172.56±7.91* 155.09±7.91** 182.58±6.88 |
与其它组比较** P<0.01;与D组比较*P<0.05
2.3 组织病理改变 A、B、D组顶叶皮层及尾壳核细胞水肿，部分核缩小，皮层细胞层状结构变紊乱，而C组的病变主要局限于尾壳核。
3 讨 论
本研究显示，MCAO 3h，c-fos mRNA被诱导出现于缺血侧广泛大脑皮层和尾壳核，而c-junmRNA仅出现于同侧皮层，且表达程度远较c-fos mRNA弱，这与它们各自表达特点的差异有关。尾壳核外侧c-fos表达非常少，这可能是因尾壳核外侧为缺血中心、能量丧失最大，从而限制了mRNA合成，此结果与其它研究中缺血中心区即早基因仅呈低水平表达或不表达[5] 的结果一致。
本实验除血糖外，其它可能影响结果的生理指标在各组间的差异均无统计学意义，保证了各组之间具有可比性，而采用Longa法复制MCAO模型，无需开颅，不存在对脑的手术损伤，可避免由于脑的直接手术损害对脑组织c-fos、c-jun表达的影响。考虑到基因表达的特点和胰岛素的起效时间，我们选择MCAO后3h作为观察胰岛素影响c-fos、c-jun表达的时间点。本实验发现，在同一剂量的胰岛素低血糖组(A组)和正常血糖组(B组)，c-jun表达无差异，说明轻度低血糖状态并没有影响到c-jun表达，这两个组与对照组间c-jun表达的差异是由于胰岛素的作用。胰岛素不论是低剂量还是高剂量均促进脑组织中c-jun表达，且高剂量时c-jun表达更多，而c-fos表达仅在高剂量时才有显著增加，这可能是由于c-jun、c-fos对胰岛素敏感性不同，但对比c-junmRNA灰度A与D、B与D组间比较的Q值与q(0.05) ， 两者相差不大 ， 就是说P值虽然小于0.05，但接近0.05,表明c-jun、c-fos对胰岛素敏感性虽有差异，但差异并不大。
高剂量胰岛素才较显著地增加c-fos、c-jun表达的原因，可能与持续高血压导致脑血管病变有关。既往研究发现，高血压持续10周的RHR，脑内小动脉出现玻璃样变，微动脉闭塞、退化，毛细血管网稀疏，皮层吻合支血管减少[6] 。MCA主干堵塞后，外周胰岛素能经发生病变的侧支循环进入缺血区的较少，而剂量过少，胰岛素的作用就可能显示不出来，使用较高剂量胰岛素，进入缺血区的胰岛素达到一定浓度，其作用始显示出来。组织病理的观察也发现，高剂量胰岛素才较显著地减轻脑缺血损害。
胰岛素的神经保护作用机制尚未弄清。White等推测全脑缺血时胰岛素可能通过促进易损区c-fos、c-jun、HSP-70基因的早期表达，减轻脑缺血损害[7] 。本研究则发现胰岛素能促进高血压大鼠局灶缺血脑组织的c-fos、c-jun表达，而且胰岛素剂量越大，这种作用越明显。大脑皮层和尾壳核中的神经元和胶质细胞均分布较多的胰岛素受体。从血循环转运来的胰岛素，与其受体结合，激活第二信使系统，而促进c-fos、c-jun表达，它们的表达产物作用于后期反应基因(Lateresponse genes),从而将细胞外短时间的刺激转换成长时程的细胞效应，故被认为是细胞信息传递通路上的“第三信使”。脑缺血早期，脑的总体蛋白合成被严重抑制，c-fos、c-jun等特殊基因的早期诱导可能对细胞的生存和恢复有重要意义，这些基因的成功诱导有利于神经元耐受缺血和生存下来，若不能诱导或诱导后中途夭折，则可能导致神经元死亡和长时间的变性与退化[8] 。结合组织病理的变化，可看出胰岛素促进缺血脑组织c-fos、c-jun基因表达是其神经保护作用的可能机制之一。
基金项目： 广东省医药卫生青年科研基金资助课题(96070)
参考文献
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收稿日期： 1999-07-19
修订日期： 1999-12-23 , http://www.100md.com