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多聚酶链式反应(PCR)，是近年发展起来的一种体外扩增特异DNA片段的技术。借助PCR，可在几个小时内，将DNA序列扩增2×105 ～2×106 倍[1] 。需要扩增的DNA样品可以是纯净的，也可以是多种生物物质的异常复杂的混合物的一小部分，这种DNA可以是组织样品，一根头发，一滴血或干尸脑部的组织，及至冰川里冻结了4万年之久的毛样。PCR具有快速、简便、灵敏、省时、对样品纯度要求不高等优点，在应用过程中具有无可比拟的优越性，被誉为“不需要细胞的基因克隆技术”。自1983年发明PCR技术以来的短短十余年中，它的应用范围迅猛扩大，已被广泛应用于疾病诊断、病原体检测、蛋白质工程、基因工程等方面。在法医调查、基础分子生物学及分子考古学等领域中均得到广泛应用。本文拟就鼠疫PCR技术的研究进展作一综述。
鼠疫菌按毒力大小不同，一般可分为强毒株，弱毒株和无毒株三类[2] 。鼠疫菌是一种变异性强的致病性微生物，在自然界中常表现为典型菌与非典型菌并存的状况，非典型鼠疫菌是指不具备典型鼠疫菌生物学特性一项或几项特异特征的菌株[3] 。在一定的条件下，典型菌和非典型菌是可以互相转换的。在鼠疫流行静息期，非典型鼠疫菌是鼠疫菌在自然界中长期保存的主要形式，而典型菌是鼠疫流行期的主要菌群。
自从1894年耶尔森和北里两位学者分离和鉴定鼠疫菌以来，人们已成功地建立起常规的病原学和血清学两种监测方法。经多年实践证明，常规的检测手段很容易检出典型的鼠疫菌，却很难检出非典型的鼠疫菌，而且，它们耗时长、敏感度及特异性不够高。目前，我国对鼠疫菌的检测主要采用血清学方法和鼠疫菌的四步检验。血清学方法只能做出追溯性诊断，四步检验虽然可靠，但耗时过长。常规的鼠疫检测方法已显示出很多缺陷。鼠疫PCR技术是以鼠疫菌的pla基因和F1抗原基因作为目的基因，通过体外扩增、结合DNA探针检测技术而建立起来的目前最先进的鼠疫病原学检测方法。
1 国外鼠疫PCR研究近况
1988年，Kathleen,A等报道了用鼠疫菌特异DNA探针直接检测宿主和蚤体中的鼠疫菌，并认为可以用于现场鼠疫监测来确定疫源地的范围[4] 。史文书等报道，用DNA探针技术检测鼠疫菌感染的动物脏器及其腐败材料获得成功[5] 。但是，DNA探针技术只能发现感染了105 以上细菌的蚤，而且，该法耗时较长。在此基础上，Hinnebusch等[6] 建立了鼠疫PCR技术。作者认为该方法是一种快速、特异、敏感的鼠疫病原学检测方法，可以检出少至10个鼠疫菌感染的蚤。用于PCR试验合成的寡核苷酸引物是基于鼠疫菌的血纤维蛋白溶酶原活化因子基因(pla)的核酸序列。引物YP1 (ATCTTACTTTCCGTGAGAAG)和YP2 (CTTGGATGAAGAGCTTCCTA)分别为相应的核苷酸971～990和1431～1450。经PCR扩增，然后琼脂糖凝胶电泳、溴化乙啶染色，可检出少至10个菌，并能发现在蚤体组织内的鼠疫菌。被试的18株来自世界各地的鼠疫菌，用pla-PCR方法直接检测，均可观察到预期的单一扩增带。而作为对照组的，与鼠疫菌亲缘的假结核菌、小肠结肠炎菌等PCR检测结果为阴性。用PCR检测于-20℃保存5个月的疫蚤发现90%阳性，70%乙醇保存的疫蚤检出55%阳性。用该法检测鼠疫菌明显优于其他方法，操作简便，只用8个小时就可得阳性结果。Campbell等[7] 介绍了一种套式PCR，可在4小时内检出鼠疫菌。套式PCR设计两对引物，一对对应的序列在模板的外侧，另一对引物互补序列在同一模板的第一对引物内侧，即第一对引物扩增的产物较长，含有第二对引物扩增的靶序列。这样经过两次PCR放大，可将单个拷贝的目的核酸检出，既可提高检出率，又可克服污染导致的假阳性。作者从pla基因中选出两对最适宜的寡核苷酸引物，扩增928bpDNA片段的内引物命名为YP1 (AAGTTCTATTGTGGCAACC)和YP2 (GAAGCGTATTGCAGACCTT);扩增458bpDNA片段的内引物命名为YP1a (CTGACAGCTTTCACAGTTGC)和YP2a (CACTCCTTTGGGAATTTCCG)。用这两对引物进行PCR试验，检测冻干的43株不同地区的鼠疫菌，结果有39株产生了预期的928bp扩增产物，占被试菌株的91%。全部被试的43株通过套式PCR都产生了预期的458bp扩增产物，其中有一株是非典型的鼠疫菌。作为对照的假结核菌、小肠结肠炎菌及大肠埃氏菌均不能产生扩增产物。鼠疫菌的pla基因和F1基因分别定位于Ppst 和PFra 质粒上，F1同时还存在于染色体上[8、9] 。研究表明，pla基因和F1基因是鼠疫菌的遗传信息中相当稳定和非常特异的分子生物学特征，不论是典型的或是非典型的鼠疫菌均具有这两种特征。以pla、F1基因建立起来的pla-PCR和F1-PCR两者结合运用，可检测任何类型的鼠疫菌株。Norkina等[9] 利用鼠疫菌特有的质粒进行PCR检测获得了成功。以Ppst 所携带的pla基因的443bp片段和PFra 所携带的F1基因的50bp片段作PCR DNA扩增的靶子，并根据F1基因序列分别设计两套寡核苷酸引物，序列分别是CAGTTCCGTTATCGCCATTCAAG(F1 )，TATTGGTTAGATACGGTTACGGT(F2 );TGGATGAATGAAAATGAATCTGAG(P1 ),ATAATATCCAGCGTTAATTACGGT(P2 )。进行PCR试验能在纯培养的细胞溶解物和生物学样品中发现和鉴定鼠疫菌DNA。用鼠疫菌无毒株(EV鼠疫菌)粗制的细胞溶解物测定PCR敏感性是10～50活菌。当靶子EV鼠疫菌与新鲜血液混合，血液含有0.4%枸椽酸钾，PCR检测水平为100～400活菌，其差别取决于制备样品的方法。Leal[10] 等报道，实验感染鼠疫菌的动物，将其脾脏捣碎，制成生理盐水悬浮液，煮沸10分钟，直接取其上清液作为PCR的模板，进行PCR反应获得成功，这样就可以避免进行复杂繁琐的DNA提取步骤，使鼠疫PCR方法大大地简单化了。
2 我国鼠疫PCR研究现状
我国于1995年开展鼠疫PCR技术研究，用于对鼠疫菌的不同生态、非典型鼠疫菌和人工感染动物样本分析[11～13] ，取得了极好的检出效果，并于1996年举办了全国鼠疫PCR检测方法首期培训班。张景林等[14] ，以pla基因上一个456bp片段为目的基因，进行PCR试验。结果表明，检测实验性感染鼠疫菌的动物脏器材料阳性率明显比细菌培养检出率高，并可用于检测腐败材料。PCR检测鼠疫菌的特异性取决于所选择序列的特异性和退火的温度。在低于或高于最适退火温度情况下，可产生非特异产物并使扩增产物的产量减少。以酚—氯仿提取DNA可提高PCR检测鼠疫菌的敏感性并可消除血液样品产生的抑制作用[5、14] 。徐菲莉[15] 等则认为，PCR方法其敏感性略低于细菌学检查，但明显高于血清学方法，然而，该法省时，省力，6小时内即可完成出结果，明显优于细菌学方法，如果将PCR与探针结合使用可能更为理想。同时使用pla-PCR和F1-PCR方法检测鼠疫菌的研究，我国正在进行之中[13] 。
3 小结
综上所述，PCR技术作为鼠疫监测研究和鼠疫诊断的新手段是切实可行的。鼠疫PCR方法具有快速、简便、敏感性高、特异性强、对待检样品纯度要求不高等优点，是目前最先进的鼠疫病原学检测方法，值得大力推广及应用。
参考文献
1 徐文忠主编.传染病预防与控制高新技术.南京：江苏科学技术出版社，1996，3：25
2 纪树立主编.鼠疫.北京：人民卫生出版社，1988，6：25
3 宋延富.鼠疫以非典型形式在自然界长期保存的研究进展.中国地方病防治杂志，1995，10(2)：101
4 Kathleen A,Falkow A.Identification of a yersinia pestis specific DNA probe with potential for use in plague surveillance.J Clin Micro.1989,26(6):2515
5 史文书，王洪喜，林景涛，等.鼠疫菌DNA探针检测鼠疫菌的敏感性研究.中国地方病防治杂志,1991，6(3)：103
6 Hinnebusch J,Schwan TG.New method for plague surveillance using polymerase chain reaction to detect yersinia pestis in fleas.
J Clin Micro，1993,31(6):1511
7 Campbell J,Reisner B. Rapid and specific identification for yersinia pestis by using a nested polymerase chain reaction procedure.J Clin Micro，1993,31(4):758
8 刘 军，李寿生，杨进业，等.从当前的疫情态势论广西鼠疫静息期防治工作重点.中国地方病防治杂志，1998，13(1)：35
9 Norkina OV,Kulichenko AN,Gintsburg AL,et al.Development of a diagnostic test for yersinia pestis by the polymerase chain reaction.J Appl Bacteriol，1994,76(3):240
10 Leal NC,Abath FG,Alves LC,et al.A simple PCR-based procedure for plague diagnosis.Rev Inst Med Trop，1996,38(5):371
11 张景林，李宏伟，王洪喜，等.鼠疫菌PCR检测方法的研究.中国地方病防治杂志，1995，10(1)：16
12 俞东征，刘 梅，王 芳.利用复式PCR技术改进F1 抗原基因探针的特异性.中国地方病防治杂志，1996，11(6)：332
13 张景林，王洪喜，王忠惠，等.应用PCR检测非黄型鼠疫菌.中国地方病防治杂志，1996，11(5)：280
14 张景林，李宏伟，王洪喜，等.PCR检测动物鼠疫方法的应用研究.中国地方病防治杂志，1995，10(5)：258
15 徐菲莉，孙 石，赵 飞，等.PCR检测鼠疫菌pla基因的敏感性及特异性试验.地方病通报，1998，13(1)：18
1998-04-28收稿。1999-01-18修回。 , http://www.100md.com