关键词：差减杂交；心肌肥厚；相关基因
摘要：本实验基于心肌肥厚过程中基因表达所发生的变化，采用cDNA差减杂交法分离其中存在表达差异的基因片段。在三个不同时期的六组材料中共分离出三十六个差异性基因片段，其中以心肌组织作为材料分离出二十四个片段，以灌流分离的心肌细胞作为材料得到十二个片段。杂交结果显示它们在心肌肥厚组和对照组中确实存在表达差异。
中图分类号：R542.2 文献标识码：A
文章编号：1001-6352(2000)04-0017-04
Isolation and identification of related gene fragments of cardiac hypertrophy in rats with subtractive hybridization
PAN De-si TIAN Chai CHENLan-ying
(Division of Biochemistry，Cardiovascular Institute and Fuwai Hospital，ChineseAcademy of Medical Sciences & Peking Union College of Medicine，Beijing 100037，China)
Abstract:Basing on thegenes expression changes in cardiac hypertrophy，we use the subtractive hybridization toisolate those expression-changed gene fragments.In six groups of materials from threedifferent periods and two different treatment procedures，respectively，there are thirtysix fragments isolated，among these twenty four are from heart tissue materials，twelvefrom perfusion isolated cardiomyocytes.They all show significant differences between thecontrol and model materials by using colony and/or dot hybridization with different cDNAprobes.
Key words:subtractive hybridization; cardiac hypertrophy; related gene
心肌肥厚是多种心血管疾病过程中的病理改变，临床表现为心肌细胞肥大和间质成份的改变(或称为心脏重塑)，心脏的顺应性和循环泵功能降低，与冠心病、心衰、脑卒中等心血管疾病的加重密切相关。近年来有关疾病相关基因的研究和分离已成为揭示疾病发生机制的重要方面，对心肌肥厚发生的分子机制的探讨也将为心肌肥厚及相关疾病的研究和治疗提供有益的线索。本研究选用腹主动脉绑扎的左心室肥厚大鼠模型，运用差减杂交法分离心肌肥厚过程中的相关基因。
1 材料和方法
1.1 动物模型的建立[1]
压力负荷型左心室肥厚大鼠模型的建立方法采用常规的腹主动脉缩窄法(雄性健康Wistar大鼠，体重200g左右)，对照组行假手术，即除不绑扎腹主动脉外其它处理均同模型组。大鼠血压测量采用颈动脉插管法。
1.2 心脏离体灌流分离左心室心肌细胞
在手术后1、3天及第4周时进行。采用简易Langendorff灌流装置按常规操作进行离体灌流[2]。取少量分离收集的细胞染色后镜检。
1.3 RNA提取及cDNA合成
心肌细胞和心肌组织的RNA提取均采用一步法。mRNA分离及cDNA合成按Promega试剂盒说明进行操作。
1.4 差减杂交
实验包括六组(每组都含模型组和对照鼠)材料，分别为术后1、3天及4周时的心肌组织和灌流分离的心肌细胞。各组材料提取RNA后，合成cDNA两端补平并加上接头(接头设计[3]1链：5'>ctcttgcttgaattcggact<3'；2链5'>agtccgaattcaagcaa<3')，经过Sephacry1400柱层析后(>300bp)，以分离的cDNA片段为模板，以接头的1链作为引物进行PCR扩增。PCR条件为：95℃预变性2min，然后进入循环扩增，95℃ 30s/50℃ 1min/70℃ 1min，共30个循环。以光敏生物素标记的模型组cDNA作为Driver，以相应的对照cDNA作为Tester进行差减杂交(Tester:Driver=1:10)；其它组别操作与此相同。68℃ 液相杂交16～20h后，加入链接亲和素孵育，随后以酚:氯仿除去生物素标记的DNA双链和单链，抽提后剩余的cDNA按照上述步骤进行新一轮杂交，4～5轮差减杂交后剩余的cDNA以EcoRI酶切并克隆入载体pBlueScript-KS，重组质粒转化受体菌JM109，建立各组相应的差减文库[4，5]。
1.5 菌落原位杂交和斑点杂交
按常规方法操作，在完全对应的两张膜上进行。菌落原位杂交采用差减杂交后剩下的对应两组(模型组和对照组)cDNA作为探针，选择有差异的菌落进一步筛选。斑点杂交采用对应两组材料的原始cDNA作为探针，挑选杂交信号差异明显的克隆子。
2 结果
2.1 术后4周时颈动脉血压及心重比值
模型组和对照组大鼠在术后4周时的颈动脉血压分别为154±10和120±8kPa(P<0.01)，非灌流心脏心重比值分别为4.59±0.04和3.31±0.15(P<0.01)，灌流后心重比值平均为6.23±1.00和4.17±0.31(g/kg)(P<0.05)。与相关文献比较[1]，本实验建立的大鼠压力负荷型心肌肥厚模型是比较理想的。
2.2 心肌细胞的鉴定
灌流分离的心肌细胞经伊红染色后镜检证实分离得到的细胞中90%为杆状心肌细胞(图1)。再经1%台盼兰染色检查细胞活性，在有效时间内(约5min)大部分细胞不着色或仅着浅色，计数统计其存活率大约为70%。
2.3 克隆子的获得
实验中共进行了包括六组材料来源的十几组菌落原位杂交，筛选了超过1000个菌落(图2)，从中挑选出一百多个杂交信号存在差异的阳性克隆子进行斑点杂交(图3)，最终得到差异明显的克隆子36个，插入片段的大小从200bp至500bp左右不等(图4)，其中从各组得到的片段列如表1。
图1灌流分离得到的心肌细胞(伊红染色)
Fig1 Perfusion isolated cardiomyocyte is rod-shaped.Magnification of ×250
图2 菌落原位杂交(差减杂交后的cDNA为探针)
Fig2 Results of colony hybridization(p,mrobed with subtracted cDNA)
A:model groups B:control groups 1.Materials of myoxardium;2.Materials of perfusionisolated cardeonyocytes
图3 斑点杂交(以原始cDAN为探针)
Fig3 Results of dot hybridization (proved with primary cDNA)
A:model groups B:control groups 1.Mateials of myocar-dium;2.Materials of perfusionisolated cardionyocytes
图4 重组质粒酶切图谱
Fig4 Restriction map of recmbinants
1.DNA/Hind ;8.control plasnid pBS-KS;2～7.restriction products of reconbinants(insertsrange fron 500bp(lane6,7)to 200bp(lane2,5)
表1 各组材料中分离得到的差异性片段
Table 1 Differentially expressed gene segments isolated from different materials
| Materials (after surgery) | total number of segments | up-regulated segments | down-regulated segments |
| Myocardium (1 day) | 4 | 3 | 1 |
| Cardiomyocytes (1 day) | 6 | 3 | 6 |
| Myocardium (3 days) | 13 | 7 | 6 |
| Cardiomyocytes (3 days) | 4 | 3 | 1 |
| Myocardium (4 weeks) | 7 | 4 | 3 |
| Cardiomyocytes (4 weeks) | 2 | 2 | 0 |
3 讨论
本研究采用灌流分离心肌细胞作为实验材料有其特殊的意义，首先它来源于模型动物，能较真实地反映心肌细胞在实验条件下在体内受到的各种刺激；其次集中探讨心肌肥厚发生过程中心肌细胞的变化，使结果分析具有针对性。实验结果表明采用灌流分离的心肌细胞与心肌组织同样适用于差减杂交法。但灌流分离操作应尽可能快地完成，因为灌流过程会改变心肌细胞在体内时的生理状况，时间越长其变化越大，而这种变化对于差减杂交法的最终目标的实现无凝会产生很大影响。在本实验中，灌流分离的过程大约1小时，短于绝大多数RNA降解的半衰期，细胞的存活率大约为70%，这样的处理不会影响最后结果的可靠性。
本实验中得到的差异性片段通过测序及序列同源性分析发现其序列与一些已知的基因序列有极高的同源性(如细胞色素b，GMP合成酶等)或一定的同源性(如Rab11b基因等)。通过与术后不同时期的cDNA探针杂交发现在心肌肥厚发生过程中一些基因的表达变化具有一定的延续性，但大部分基因片段在不同时期的材料中没有重复出现；同时以心肌细胞或心肌组织为材料得到的结果也有很大不同，说明两者反映的是心肌肥厚中不同侧面的问题，提示在心肌肥厚发生中基因表达调控所具有的时间和空间上的复杂变化。
差减杂交法分离基因的优点在于直接针对疾病发生过程分离出相关基因，而不需要对疾病的生理生化有太多了解，它在诸多领域已有了广泛应用，但是在心肌肥厚的研究中仍较少采用。本研究运用cDNA差减杂交法分离大鼠压力负荷型心肌肥厚的相关基因并已经得到一些基因片段，对于差减杂交法在本领域的应用不失为一次有益的尝试。
基金项目：本研究受国家自然科学基金资助(No.39670299)
参考文献
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收稿日期：1999-01-21
修订日期：1999-07-20 , 百拇医药