关键词：1 -型糖尿病；基因多态性；顺式作用元件；反式作用因子
摘要: 应用聚合酶链反应(PCR)、PCR/SSCP和克隆测序等方法比较分析汉族1-型糖尿病患者与正常对照者HLA-DQB1 5'-调控区多态性。结果显示携带不同等位基因的患者与对照者DQB1 5'-调控区y、sbox核苷酸序列相同，且与白种人基因结构一致；y box核苷酸序列存在二种结构，CCTAGAGACAGATT序列常常与DQB1 .0302等位基因在同一单倍型；转录起始位点至ybox间-44至-61位存在多态性，-59至-61位AAG等位基因可能与1-型糖尿病易感相关联；在2例携带DQB1 . 0601等位基因患者的-131至-128位间发现CACC→ACAA单个碱基取代突变。表明HLA- DQB1 基因5'-调控区主要作用元件旁侧核苷酸变异可能参与1-型糖尿病的病因学。
中图分类号：R587.1 文献标识码：A
Sequenceat the 5'flanking regulatory region of HLA-DQB1 gene in Hans
Chinese population and its association with susceptibility to IDDM
SONG Chang-xing ，HU Xiu-ling ，QIU Chang-chun ，et al.
(Institute of Beijing Tuberculosis and Chest Tumour ，Beijing 101149 ，China )
Abstract :To analyse the polymorphism atthe 5'flanking regulatory region of HLA-DQB1 gene and its association withsusceptibility to typeI diabetes in Hans population.Polymorphism of HLA-DQB1 promoter region (QBP) in Hans IDDM patients and normal controls have been identified by PCR, PCR/SSCP and PCR/sequencing methods .Nodifferences were found in y and s box between patients and controls carrying differentallele as well as in different ethnic groups. There are two different sequences in x box ，but CCTAGAGACAGATT sequence locates frequently on the haplotypewith DQB1 . 0302 allele. Polymorphism between transcription point andy box (at position -44 ～-46 and -59 ～-61) might be associated with the genetic susceptibility to IDDM.Additionally ，a new single base mutant (CACC →CAC A ) was found at position -131 and -128 in two patientscarrying DQB1 . 0601 allele. These results suggest that thepolymorphism and variants at 5'- flanking regulatory region of DQB1 gene mightinvolve in the pathogenesis of IDDM .
Key words ：type I diabetes mellitus;Gene polymorphism ；Cis regulatory element ；Transaction factors
人白细胞抗原(Human Leukocyte Antigen,HLA)是由a和b链组成的高度多态性的杂合二聚体跨膜糖蛋白。人们对DQa,DQb链氨基酸组成，特别是b链57位非天门冬氨基酸和α链52位精氨酸与1-型糖尿病的关联已有广泛研究[1，2] 。但是,HLA-DQb链57位氨基酸与疾病的关系是由编码基因本身结构改变所决定，还是与这些等位基因在同一单体型上的其它未知位点，特别是5'调控区多态性所引起的差异表达而导致DQb分子量变决定和/或参与疾病发生？人们对此仍了解甚少。
细胞表面HLA分子表达数量主要由转录水平调节，只有当调控区顺式作用元件与核蛋白相互作用才能启动转录表达。一般来说在正常生理条件下，HLA-DQA1，DQB1不同位点可协同表达。在过去的研究中人们已发现不同HLA-Ⅱ类等位基因或相同等位基因在不同个体中的表达水平明显不同，导致表达水平变化的主要原因来自控制转录反应的关键部位结构变异，特别是HLA-Ⅱ类基因5'上游启动子中的几个核心作用元件x，y和s/wbox及其两侧的高度保守区核苷酸序列改变将直接影响等位基因的表达水平[3～8]。本文进一步比较分析了不同DQB1等位基因5'上游启动子核苷酸序列及携带相同等位基因1-型糖尿病患者与对照个体间启动子中主要元件x，y，sbox结构的差异，意在从表达调控水平阐明1-型糖尿病的发病机理。
1 材料与方法
1.1 研究对象
按WHO糖尿病诊断标准确诊的20例汉族1-型糖尿病患者及他们的家系成员共67人。病例选自北京结核病医院和市郊区县医院门诊病人。患者发病年龄<20岁者9例，20～40岁者8例，病程至少4年以上。其中12例有酮症或酮症酸中毒史。所有患者均接受胰岛素治疗。按年龄?性别匹配从同一地区选择20例正常对照者，均无糖尿病及其他自身免疫病家族史。
1.2 DNA提取及个体HLA-DRB-DQB1-DQA1单体型分析
用酚/氯仿常规方法从外周血白细胞中提取基因组DNA，其纯度为A260:A280≥1.8[9] 。以序列特异性引物的聚合酶链反应(PCR/SSP)技术检测每个个体HLA-DRB-DQB1-DQA1单体型及DQB1基因型和等位基因。
1.3 克隆测序
选取携带不同DQB1等位基因的糖尿病患者与携带相同DQB1等位基因正常对照者的基因组DNA作为模板，用引物
P1 5'-CTCGGATCCAATCAATATTACAAAGAT-3’
P2 5'-GTCCTGCAGACATAATTGAGACGAAG-3'
扩增其 5'上游调控区。PCR产物用QiA quick PCR purification Kit(Germany)纯化。纯化的PCR产物与pGEMTeasy载体连接(promega Co.,USA),按Pharmacia公司提供的操作程序将其转染至大肠杆菌，采用alpha插入失活/蓝白斑法筛选阳性克隆。并应用ABI377自动测序仪完成序列分析。
2 结 果
2.1 糖尿病患者DRB-DQB1-DQA1单倍型分析
应用序列特异引物直接聚合酶链反应(PCR/SSCP)方法，鉴定20例汉族1-型糖尿病患者HLA-DRB、DQA1、DQB1基因型别和单体型，结果列于表1。
2.2 汉族人HLA-DQB1基因5'调控区x,y,s box结构
从20例型糖尿病患者和20例对照者中选择携带DQB1*0201，0301，0302，0303，0304,0601等位基因个体各2例，调控区PCR产物克隆测序结果显示：(1)不同等位基因5'调控区y,sbox核苷酸序列相同(如图1所示)，y box含10个核苷酸，其序列为CTG ATT GGTT(图1a)；s box含7个核苷酸，序列为GAA CCT T(如图1b)；(2)x box由20个核苷酸组成，有两种不同序列(图2a,b)即CCCAGA GAC AGA TG和CCT AGA GAC AGA T T，在该人群中频率分布分别为67%和33%，前者常常与DQB1*0301在同一单体型，而后者常与BQB1*0302在同一单体型。
2.3 转录起始点与y box间序列特点
如图3所示，-44至-46位存在TGC和TAC两种等位基因；-59至-61位存在两种等位基因AGG和AAG，而83%1-型糖尿病患者含AAG等位基因。
2.4 x, s box间新的碱基突变
在两例携带DQB1*0601/0601等位基因1-型糖尿病患者(见表1中No.7和No.16)，发现其x,s box间-131至-128位为CACC，而正常野生型序列为CACA，即-128位发生A→C单个碱基取代，此取代恰发生在DR2(15)-DQB1*0601单体型上。
表1 1 -糖尿病患者DRB-DQB 1 -DQA 1 单体型
Table 1 The haplotype of HLA-DRB-DQB 1 -DQA 1 in the
patient with 1 type diabetes
| No | DRB(B1 B3 B4 B5 ) | DQB1 | DQA1 |
| 1 | DR2(15)-DR51/DR8 | 0201/05 | 0102/0401 |
| 2 | DR4-DR53/DR7-DR53 | 0201/0302 | 0301/0201 |
| 3 | DR2(15)/DR9 | 0303/05 | 0102/0301 |
| 4 | DR2(15)-DR51/DR7/DR7 | 05/0601 | 0102/0201 |
| 5 | DR2(15)-DR51/DR8 | 0601/06 | 0102/0401 |
| 6 | DR2(15)-DR51/DR9-DR53 | 0303/06 | 0102/0301 |
| 7 | DR2(15)-DR51/DR2(15)-DR51 | 0601/0601 | 0102/0102 |
| 8 | DR3/DR9 | 0201/0303 | 0501/0301 |
| 9 | DR4-DR53/DR9-DR53 | 0302/0303 | 0301/0301 |
| 10 | DR5(11)/DR9 | 0301/0303 | 0501/0303 |
| 11 | DR6(13)-DR52/DR7-DR53 | 0201/06 | 0102/0201 |
| 12 | DR8-DR52/DR10 | 0501/0601 | 0103/0301 |
| 13 | DR2(15)/DR2(15) | 0601/0601 | 0102/0501 |
| 14 | DR4-DR53/DR5(11)-DR52 | 0301/0302 | 0301/0501 |
| 15 | DR3/DR10 | 0201/0501 | 0501/0301 |
| 16 | DR2(15)-DR51/DR2(15)-DR51 | 0601/0601 | 0102/0103 |
| 17 | DR7-DR53/DR8 | 0303/0402 | 0201/0401 |
| 18 | DR5(11)-DR52/DR9 | 0301/0303 | 0501/0301 |
epom等认为某些HLA-类分子由于其抗原结合槽氨基酸组成不同，可以不同亲和力结合和提呈抗原，使T淋巴细胞激活并启动自身免疫反应[5] 。然而，上述推测尚不能完全解释自身免疫病的发病机理。
图 1 HLA-DQB 1 *0302 0301 等位基因5'上调控区y s
box 核苷酸序列
Fig 1 Sequence of Y and S box of HLA-DQB 1
promoter in Chinese population.
图 2 HLA-DQB 1 调控区x box 序列 (“↓”标记处示碱基取代位置)
Fig 2 Sequence of X box of HLA-DQB 1 promoter in
Chinese population.
a Frequent sequence in the haplotype carrying
DQB 1 *0301 allele.
b Frequent sequence in the haplotype carrying
DQB 1 *0302 allele.
图 3 转录起始点与Y box 间-44 至-61 位序列
Fig 3 The mutations between transcription initial site and Y box.
a.Normal sequence b.Mutations.
图4 128 位A C 单个碱基取代突变
Fig 4 A new base substitution A→C at 28
position of the HLA-DQB 1
promoter in two diabetic patients carrying DQB 1 *0601 allele
a.Normal sequence;b.Mutation -128 A→C.
T细胞活化与抗原提呈不仅取决于高度多态性的HLA-类分子(DR,DQ)结构特异性，也取决于免疫系统细胞表面HLA-类分子的表达水平，而基因表达是在转录水平受顺式调控元件和反式作用因子相互作用的调控。因此，HLA-类基因调控区多态性及HLA-类抗原分子表达的翻译或翻译后调节也是了解免疫应答调节机制的一个重要方面。
本研究结果证实DQB1各等位基因的相应调控区y,s box核苷酸结构不仅在Ⅰ-型糖尿病患者与对照者间是相同的，而且汉族与白种人的序列也相一致[3] ，说明这些元件具有高度保守性。xbox存在两种序列，后者常常与I型糖尿病的DQB1*0302易感基因在同一单体型，该结果提示，DQB1*0302等位基因与易感糖尿病正相关，因其结构基因编码HLA的b链57位为非天门冬氨酸导致抗原结合槽构型改变；顺式调控元件核苷酸序列不同也影响其与核蛋白的相互作用从而改变了DQB1位点的各等位基因表达的组织特异性和/或发育阶段特异性以及表达水平的变化[8～10] 。1-型糖尿病胰岛b细胞HLA-II类抗原异位表达，可能与调控区核苷酸结构改变有关。我们以前曾报告DQA1调控区核苷酸变异与1-型糖尿病的关系[9] ，所有上述研究资料为从表达调控水平阐明1-型糖尿病发病机理开辟了新思路。
此外，在2例携带DQB1*0601/0601基因型1-型糖尿病个体发现x,s box间-131至-128位发生CACA→CACC单个碱基取代突变。DQB1*0601等位基因与DR2(15)在同一单体型，普遍认为DR2与1-型糖尿病抗性相关联。所以，推测-131至-128位碱基突变，可能影响DQB1基因诱导表达，使DQB1和DQA1的协同表达失去平衡。导致个体的免疫应答反应产生变化，而发生疾病。此结果有待进一步扩大标本量予以证实。
基金项目：国家自然科学基金(39670693) ;北京市自然科学基金(7962005)
作者单位：刘忠泉(北京市结核病胸部肿瘤研究所， 北京 101149)
时广利(北京市结核病胸部肿瘤研究所， 北京 101149)
周文郁(中国医学科学院基础医学研究所中国协和医科大学基础医学院，北京 100005)
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收稿日期：2000-04-18 修回日期：2000-06-01 , 百拇医药