 [点击上图放大] |
关键词：类风湿性关节炎；G1特异性T细胞
[摘 要] 目的 为比较研究类风湿性关节炎病人T细胞库中是否存在G1特异性T淋巴细胞极其生物学特性。方法 应用重组人软骨抗原凝集原G1为抗原(rG1)，采用国际标准半有限稀释建立细胞株法，从类风湿性关节炎病人外周血中分离建立G1特异性T细胞并分析其生物学特性。结果 从4名类风湿性关节炎病人外周血中分别分离建立了13株G1特异性T细胞株。分析比较了这些细胞株，发现病人的G1特异性T淋巴细胞出现频率为36.2%。所有T细胞株与rG1及WT和PPD共同培养以观察其特异性反应性，结果发现所建立的13株T细胞株对人软骨抗原凝集素G1区具有良好的特异性。进一步用rG1肽段分析，发现其中5株主要对G1C末端呈特异性反应。细胞表型分析发现，所有这些T细胞株均表现为CD3+ 、CD4+ 与αβ TCR阳性；细胞因子分泌类型以TH1为主。结论 RA病人外周血与关节滑膜液中均有G1特异性T细胞。
[中图分类号] R392.12 [文献标识码] A
[文章编号]1000-8861(2000)04-0283-04
The isolation of autoreactive T cells specific to aggrecan G1 domain from rheumatoid rathritis patients
LI Ning-li1 ，ZHANGDong-qing1 ，NIE Hong1 ，ZHOU Guang-yan1 ，CARTMAN A2 ，LEROUX JY2 ，POOLE AR2 ，ZHANG YP2
(1.Shanghai Institute of Immunology，Shanghai Second Medical University，Shanghai200025，China； 2.Joint Diseases Laboratory， Shriners Hospital，Affiliated withMcGill University，Montreal，Canada)
[Abstract] Objective Toelucidate whether autoreactive T cells to G1 are expressed in rheumatoid arthritispatients.Methods We analyzed the frequency of human G1-specific T cells in theperipheral blood of four rheumatoid arthritis patients and tried to establish G1-reactiveT cell lines from these rheumatoid arthritis patients with split well technique.ResultsThe G1-specific T cells in PBL were detectable at the range of 36.2% in peripheralblood lymphocytes.We have also generated 13 G1-specific T lymphocyte lines from thesepatients.All these cells expressed fine specificity to human recombinant G1，but not tounrelated antigen.They expressed apan-T cell marker CD3 and CD4 and selectively used theαβ T cell receptor. Moreover，most of lines expressed the Th-1 cytokine profile，characterizedby interferon-γ positivity and IL-4 negativity.No Th-2 type cell line was generated.ConclusionThese data provide strong evidence in favor of the presence of autoreactive T cells in therheumatoid arthritis patients.
[Key words] rheumatoid arthritis； rG1-specific T cell lines
类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种常见病，多发病。目前对RA的发病机理与致病因素的研究已经极为深入。越来越多的证据表明自身免疫反应参与该病的发生与发展。例如已发现在RA病人的关节滑膜液中富含T、B淋巴细胞与抗原提成细胞，而且滑膜中浸润的T细胞多表达IL-2R、IL-10和IFN-r，外周血中含有CD4+ 的活化T细胞，提示有免疫反应产生[1，2] 。已报道的参与激发免疫反应的自身抗原有多种，如胶原Ⅱ、Ⅸ、Ⅺ软骨糖蛋白、连接蛋白等[3，4] 。其中对软骨糖蛋白的深入研究发现，位于其凝集原的N端的G1区是该蛋白主要抗原部位[4] 。如用牛G1注射Babl/c小鼠可引起关节的慢性损伤，同时拌有多发性脊柱炎。RA病人的外周血在体外对G1也表现也很强的细胞免疫。为了进一步研究G1T细胞的特性及其致病机制，我们采用重组人G1(rG1)从RA病人的外周血与滑膜液中分离出G1特异性T细胞。所有这些T细胞株多表现为CD4+ 、αβTCR阳性，但有少数表达γδTCR。我们还比较了关节滑膜液中与外周血中的T细胞频率、细胞因子分泌类型及BV取用特点。
1 材料与方法
1.1 病人 4名RA病人来自Montreal总医院风湿科，取外周血，男性1名，女性3名；平均年龄52岁。
1.2 重组人G1(rG1) 人的G1用GIBCO/BRL于Bacmic线病毒表达系统产生。简述之：PCR扩增包括凝集素信号肽与第6外显子终止部分(cDNA：aggrecan cDNA由RONGHLEY博士惠赠)。在分子末端添加6个组氨酸的Tag；PCR产物连入PfastBac1载体中(GIBCO/BRL)；使用GIBCO/BRL Bacomid表达试剂盒筛选重组线病毒(bacluvirus)；用该病毒感染SF21昆虫细胞，3～4 d，产生蛋白。使用QIAGENNickle-agrose纯化试剂盒纯化G1蛋白。SDS-PAGE与Western blot分析鉴定所表达的蛋白。测定蛋白浓度，过滤除菌备用。
1.3 人工合成G1肽段 使用标准Fmoc(9-fluorenylmethoxycarbonyl)化学法、固相合成仪(Applied Biosystems，Inc，Foster City，CA)合成人G1肽段(1-367氨基酸残基)。每个肽段长27个氨基酸；相邻肽段至少重复5个氨基酸，共20个肽。使用反相色谱仪(prep-10 aquapore C8柱；Applied Biosystem，Inc)，0.1% trifluoroacetic acid的acetonitrile梯度纯化。
1.4 rG1特异性T细胞株建立 rG1特异性T细胞株的建立采用标准的半有限稀释法[5] 。简述之：抽取RA病人外周静脉血和关节滑膜液，分离PBL和关节滑膜液细胞。初次培养：用5%自体血清的RPMI-1640调整PBL和关节滑膜液细胞的浓度为1×106 /ml，在96孔U形培养板中加入100 μl细胞悬液及终浓度为20 μg/ml的rG1。37 °C，5% CO2 培养3 d。先收取上清存放于-80 °C以备测细胞因子分泌格局；然后加入含有IL-2(20 u/ml)的新鲜5%人AB血清RPMI-1640100 μl，以后每隔3 d换液1次，直至2周。
1.5 rG1特异性T细胞出现频率分析 于第3周再次采血，分离PBL，40 GY/s照射使成为APC。将初次培养的T细胞(4×106 /孔)与APC(1×105 /孔)混合，加rG1(20 μg/ml)共同培养3 d；3 H-TdR(NEN Boston，MA)掺入(0.2 μCi/孔)16 h后，Sktron多头收集仪(Norway，PO，Box-3401 LIER)收集细胞，β液闪仪(Canberra Company)测定cpm值。选择刺激指数(stimulation Index，SI)大于3者为rG1阳性T细胞。计算阳性孔数，统计rG1特异性T细胞频率。
1.6 再刺激与rG1特异性分析 扩增与特异性分析同上述频率分析。
1.7 细胞因子测定 采用Quantikine ELISA Kits定量检测所收集的不同时期T细胞株培养上清中IFN-r与IL-4。
1.8 rG1特异性T细胞株表型分析 采用直接标记免疫荧光法分析表型。简述之：用以5×105 /T细胞与直接荧光标记的鼠抗人特异性单抗(详见下)冰浴20min，PBS洗涤1次后流式细胞仪(Coulter Cytometer，EPICSXL4 cytometer)检测。所用单抗均购自Coulter公司。FITC-CD4；PE-D8；Pcy5-CD3；FITC-γδ；PE-αβ；分析软件：SystemⅡ。
2 结果
2.1 RA病人外周血中的G1特异性T细胞频率 见表1。在4名RA病人的外周血发现有较高频率的G1特异性T细胞，平均为36.2%，远远高于健康人的外周血中的rG1特异性自身反应性T细胞。提示RA病人体内具有很高频率的rG1特异性T细胞。
表1 RA病人外周血G1特异性T细胞出现频率
Tab 1 The frequency of G1-specific T cell in PBL of RA patients
| patient | fequency of rG1 specific T cell lines |
| 3 | 18 |
| 4 | 50 |
| 5 | 60 |
| 6 | 17 |
| average | 36.2 |
表2 T细胞株对G1表现出良好的特异性
Tab 2 The fine specificity of rG1-specific T cell lines
| T cell line | antigen(SI) | ||||
| rG1 | WT | PPD | R15 | R16 | |
| 1-1 | 7.9 | 0.21 | 3.7 | ||
| 1-2 | 7.2 | 0.67 | 1.3 | 5.1 | 388.1 |
| 1-4 | 4.5 | 0.14 | 0.9 | ||
| 1-6 | 1.1 | 5.2 | 2.1 | 48.8 | |
| 1-8 | 20.3 | 0.6 | 1.2 | ||
| 2-9 | 6.3 | 2.7 | 0.59 | ||
| 2-37 | 3.1 | 1.0 | 1.1 | ||
| 3-3 | 2.3 | 0.3 | 1.5 | 10.5 | 19.1 |
| 3-4 | 7.7 | 0.5 | 1.3 | ||
| 3-6 | 28.0 | 10.7〓 | 2.4 | ||
| 3-9 | 3.9 | 1.1 | 1.7 | ||
| 3-10 | 17.2 | 1.0 | 4.3 | ||
| 4-2 | 3.9 | 1.4 | 4.3 | ||
图1rG1特异性T细胞株表型
Fig 1Phenotype of G1 specific T cell lines
2.4 rG特异性T细胞株的细胞因子分泌格局 分别收集初次培养(即抗原初次刺激后3d)，阳性频率分析(即第2次再刺激)与特异性分析(第3次再刺激)时的T细胞株培养上清，ELISA法测定细胞因子分泌。结果表明：初次培养时，无可测得细胞因子分泌；第2次再刺激时，所有细胞株均表现为IFN-r分泌，呈Th1因子分泌类型(见表3)。
表3 rG1特异性T细胞株的细胞因子分泌格局
Tab 3 The cytokine profile of G1-specific T cell lines
| T cell line | cytokine concentration | T cell subset | |
| IFN-(pg/ml) | IL-4(pg/ml) | ||
| 2-9 | <15 | <15.00 | ？ |
| 2-37 | 46.69±2.41 | <15.00 | Th1 |
| 3-3 | 102.56±6.73 | <15.00 | Th1 |
| 3-4 | 361.66±4.35 | <15.00 | Th1 |
| 3-9 | 15.65±26.83 | <15.00 | Th1 |
| 3-10 | 76.98±3.07 | <15.00 | Th1 |
| 1-4 | >1 000.00 | <15.00 | Th1 |
| 1-6 | >1 000.00 | <15.00 | Th1 |
| 1-8 | >1 000.00 | <15.00 | Th1 |
3 讨论
对软骨抗原而产生的自身反应是RA的重要发病机理之一[6] 。有关的自身抗原有多种，其中人软骨糖蛋白(proteoglycan，PG)凝集原(aggrecan)受到人们的关注。因为G1位于凝集原蛋白的氨基末端，其分子卷曲成球形。凝集原通过G1球形结合区与软骨基质(cartilage matrix)的透明质酸结合，所以G1又称为透明质酸结合区。G1区由374个氨基酸组成。是PG作为自身抗原的关键部位[7] 。RA病人的外周血淋巴细胞也对G1表现出很强的细胞免疫。T细胞和B细胞均可特异性的识别牛的G1区[3] 。我们用人重组G1从RA病人外周血与关节滑膜液中建立了G1特异性T细胞，并分析了这些T细胞株的细胞表型和细胞因子分泌类型。
对G1特异性T细胞的出现频率进行了分析，发现尽管有个体差异，但平均RG的出现频率远高于健康人。外周血中G1特异性T细胞频率达36.2%。对所建立的rG1特异性T细胞系再用G1及其肽段进行特异性分析，而且为了排除G1表达系统(如培养基成份，病毒载体)对所建立细胞株的影响以极剔除非特异性与PPD有交叉反应的T细胞，本实验分别检测了所建T细胞对G1肽段(共20个)、表达系统上清(WT)及PPD的反应。结果表明：所建T细胞对G1表现出良好的特异性。在对所建立的T细胞株与G1肽段的分析中发现了一个有趣的现象：我们曾报道在用G1免疫小鼠后所建立的T株对G1的识别表位在70～84肽段，而肽段150～169与70～84相比是亚优势表位。无论有或无KS链，能识别G1的T株均能很强烈地与这一肽段起反应，而且150～169这一肽段位于凝集原核心蛋白的绝对保守区内[8] 。但在本实验中并未发现与上述两肽段有交叉反应的现象；与此相反的是：所分离的G1特异性T细胞中有2株对G1C端肽段R16(氨基酸残328～353)表现为很强的的特异性，3株对G1C端肽段R16(氨基酸残基349～374)表现为很强的特异性。提示这些结构蛋白也可以直接激活宿主免疫系统而产生自身反应性T细胞。
Th细胞根据T细胞分泌的细胞因子至少可分为Th1与Th2。前者以分泌IFN-r为特点而后者以分泌IL-4为代表[9] 。本文报道的T细胞株在第2次再刺激后，细胞因子分泌格局表明大部分细胞株均为Th1，即IFN-r分泌型T细胞，但有1株测不出细胞因子分泌，表明在rG1特异性T细胞系中，以Th1为主要细胞亚群，与MBP刺激产生的T细胞株不同(张冬青等，待发表资料)。这与在关节滑膜中发现的T细胞通常表达IFN-r的研究报到相一致[2，10] 。提示：rG1特异性T细胞系所诱导的自身免疫反应以细胞免疫为主。
本文首次报道了用rG1在体外从RA病人的外周血中建立了rG1特异性T细胞株。rG1特异性T细胞株出现频率分别为远远高于正常人外周血rG1特异性自身反应性T细胞并以Th1细胞为主。对BV优势取用研究发现：大多数T细胞株取用αβ，这些细胞株在RA发病机制中的作用正在研究中。
[作者简介] 李宁丽(1957-)，女，山东临沂市人，副教授，博士，主要从事免疫调节与自身免疫病的研究。
；CARTMAN A(Joint Disease Laboratory，Shriners Hospital Affiliated with McGill University，Montreal，Canada)；LERUOX JY(Joint Disease Laboratory，Shriners Hospital Affiliated with McGill University，Montreal，Canada)； POOLE AR(Joint Disease Laboratory，Shriners Hospital Affiliated with McGill University，Montreal，Canada)；ZHANG YP(Joint Disease Laboratory，Shriners Hospital Affiliated with McGill University，Montreal，Canada)
[参考文献]
[1] BANERJEE S，WEBBER C，POOLE AR.Theinduction of arthritis in mice by the cartilage proteoglycan aggrecan：role of CD4+ and CD8+ cells[J].Cell Immunol，1992，144(2)：347-357.
[2] GOLDS AA，STEPHEN IBM，ESDAILE JM，et al.Lymphocyte transformation toconnective tissue antigen in adult and juvenile rheuamatoid arthritis，osteoarthritis，ankylosingspondylitis，systemic lupus erythematous and a nonarthritic control population[J].Cell Immunol，1983，82(4)：196-209.
[3] GLANT TT，MIKECA K，ARZOUMANIAN A，et al.Proteoglycan induced arthritisin BALB/C mice.Clinical fractures and histopathology[J]. Arthritis Rheum，1987，30(1)：201-212.
[4] STUART JM，WATSON WC，KANG AH.Collegen autoimmunity and arthritis[J].FASEB J，1988，2(11)：2 950-2 956.
[5] ZHANG JW，MARKOVIC S，LACET B，et al.In-crease frequency ofinterluhin-2 responive T cells specific for myelin basic protein and roteolipid protein inperipheral blood and cerebrospinal fluid of atients with multiple sclerosis[J].J ExpMed，1994，199(3)：973.
[6] POOLE AR.Cartilage in health and disease.[M].In：KOOPMAN WJ，ed.Arthritis and allied conditions. 13th ed.Baltimore：Williams ＆ Wilkins.1997.255-308.
[7] LEROUX JY，GUERASSIMOV A，CARTMAN A，et al.Immunity to the G1 GlobularDomain of the cartilage proteoglycan aggrecan can induce inflammatory erosivepolyarthritis and spondylitis in BALB/C mice but iminity to G1 is inhibited by couaentlybound keratan sulfate in vitro and in vivo[J]. J Clin Invest，1996，97(3)：621-632.
[8] ZHANG YP，GUERASSINOV A，LEROUX JY，et al.Arthritis induced byproteoglycan aggrecan G1 domain in Balb/c mice：Evidence of T cell involvement and theimmunosuppressive influence of keratan sulfate on recognition of T and B cell epitopes[J].JClin Invest，1998，101(8)：1 678-1 686.
[9] ROMAGNAIN S.The Th1/Th2 paradigm [J]. Immunol Today，1997，18(9)：163-165.
[10] MANICOURT DH，TRILI R，FUKUuDA K，et al.Levels of circulating tumor necrosisfactor and interleukine-6 in patients with rheumatoid arthritis[J].ArthritisRheum，1993，36(2)：490-495.
[收稿日期] 2000-01-03 (李宁丽 张冬青 聂红 周光炎 CARTMAN A LERUOX JY POOLE AR ZHANG YP)