关键词：同型半胱氨酸；微团细胞培养；中脑细胞
摘要 ：为深入揭示同型半胱氨酸(homocysteine,HCY)的致畸性及作用机理，应用大鼠胚胎中脑细胞微团培养法探讨了HCY(0～10mmol/L)对胚胎中脑细胞增殖和分化的影响。结果显示：随着剂量的增加，HCY对胚胎中脑细胞分化具有促进和抑制双相作用，半数抑制分化浓度(IC50 )为4.3mmol/L，当加入肝微粒体S9时，IC50 减至2.3mmol/L；在实验剂量范围内，HCY对中脑细胞增殖无明显抑制作用。上述结果说明HCY对大鼠胚胎中脑细胞分化的影响明显高于对细胞增殖的影响，它可能在HCY导致神经管畸形的过程中起重要作用。
中图分类号 ：Q 132.7 Q 593.2 文献标识码 ：A
文章编号 ：1000-8020(2000)01-0043-03
Effect of homocysteine on the proliferation and
differentiation of rat embryo midbrain cell
Liu Hong,Li Yong,Ye Hongmao,Zhao Zhirong，etal.
(National Center of Maternal and Infant Health,Beijing Medical University,Beijing 100083,China)
Abstract ：Inorder to determine the potential mechanisms by which HCY may exerts its teratogeniceffects,a micromass culture for rat embryo midbrain cell was used to reveal thedifferentiation and proliferation of the cell under different HCY doses (0—10mmol/L).Theresults showed that with increased concentration of HCY,the promotion effect changed intoinhibition.The concentration inhibiting the formation of differentiated foci by 50% of thecontrol was 4.3mmol/L,and 2.3mmol/L when S9 was added.It had an inhibition effects onproliferation in the testing scope.The result suggested that HCY obviously inhibited morecell differentiation than proliferation.The teratogenic hazard of HCY may play animportant role in the occurrence of neural tube defects.
Key words ：homocysteine,micromass culture,midbraincell
出生缺陷是影响我国人口素质的重大问题，其中常见的有神经管畸形(neuraltube defects,NTDs)和先天性心脏病(congenital heart defect,CHD)等。关于NTDs的病因，近年人群流行病学研究显示叶酸缺乏是NTDs发生的危险因素之一，而叶酸缺乏可以引起高同型半胱氨酸血症(homocysteinemia)。研究发现NTDs及CHD患儿母亲血中同型半胱氨酸(homocysteine,HCY)高于正常对照，提示HCY与先天缺陷的发生有关[1，2] 。但在哺乳动物中尚缺乏HCY致畸的直接证据。本实验采用大鼠胚胎中脑细胞微团培养法研究HCY对哺乳动物胚胎细胞增殖和分化的影响[3，4] ，旨在为阐明HCY对神经系统发育的损害及其作用机理提供实验依据。实验中取正在分化的中脑细胞，经高密度培养分散的中脑细胞可组成细胞团并增殖分化为神经细胞。检测时用集落数反映细胞分化情况，用细胞数代表其增殖能力。部分培养液中加入肝微粒体S9模仿代谢活化系统，以探讨HCY经母体代谢后对胚胎细胞的作用。
1 材料及方法
1.1 实验动物
成年健康二级SD大鼠，由北京医科大学动物部提供。按常规方法交配获取孕鼠，见阴栓之日定为妊娠第0天。
1.2 试剂及仪器
D，L-HCY、维生素A、HamF12培养基、胎牛血清、小牛血清、胰蛋白酶、噻唑蓝(MTT)均为Sigma产品；HamF12培养基使用时加10%胎牛血清，pH7.2。其他：肝微粒体S9由北京医科大学营养教研室提供，按2.5μl/ml加入培养基。苏木精染液、Hanks液按常规方法配制。
1.3 方法
1.3.1 胚胎中脑细胞制备 脱颈椎法处死妊娠第13天的孕鼠，在无菌条件下取出子宫，分离胚胎。用Hanks液清洗2～3次，选择体节数为34～36的胚胎转移到马血清Hanks(1∶1)液中。按图1所示部位用眼科剪取出中脑。将剪下的组织用D-Hanks液清洗3次后，剪碎加入1%胰酶，室温静置消化20分钟；用培养基终止消化，并清洗2～3次。滴管反复吹打使之成为细胞悬液，经两层纱布过滤。台盼蓝排斥法计数细胞存活率为90%～95%，调整细胞密度到5×106 个/ml。
1%胰酶37℃20min
图1 胚胎中脑示意图
1.3.2 对照实验 维生素A有明显致畸作用[3] ，将其做为阳性对照物加入培养基中，分5个浓度组(0.0125、0.125、1.25、12.5和25μg/ml)，进行细胞分化与增殖实验。
1.3.3 细胞分化实验 采用微团培养。用24孔培养板，每孔加入细胞悬液50μl，在上述条件下预培养2h，每孔分别加入2ml含有不同浓度受试物的培养基，连续培养5天。用苏木精染色后盲法在低倍镜下计数集落数。上述实验每一剂量组设6个平行样，实验至少重复3次。
1.3.4 细胞增殖实验 用96孔细胞培养板，每孔加入细胞悬液10μl，37℃CO2 孵箱预培养2h后，加入含不同浓度HCY或HCY+肝微粒体S9的培养基，连续培养5天。吸去培养基，加入5mg/mlMTT20μl/孔，37℃避光4h，加入DMSO100μl/孔，放置15min待溶液清亮后酶标仪在波长570nm比色。活细胞线粒体在代谢过程中与MTT形成有色甲FDA3，故可用光密度值反映存活细胞数目。
1.3.5 统计处理 采用Graph统计软件进行方差分析，并计算半数抑制分化浓度(IC50 )。
2 结果
2.1 阳性对照物维生素A的实验结果
对中脑细胞分化和增殖的半数抑制浓度(IC50 )分别为6.4μg/ml和13μg/ml，与报道相似，证明所建方法可靠(表1)。
表1 维生素A对大鼠胚胎中脑细胞增殖和
分化影响的实验结果(n=4,
±s)
| 维生素A (μg/ml) | 分化实验 | 增殖实验 |
| 集落数 | 光密度值 | |
0.0 | 84±5.8 | 0.187±0.008 |
| 0.0125 | 90±8.3 | 0.188±0.001 |
| 0.125 | 72±5.2(1) | 0.174±0.002(2) |
| 1.25 | 59±4.2(3) | 0.168±0.002(3) |
| 12.5 | 21±7.3(3) | 0.156±0.004(3) |
| 25.0 | 1±1.9(3) | 0.131±0.001(3) |
2.2 HCY对胚胎中脑细胞分化的影响
为双相作用当HCY剂量低于1.0mmol/L时，促进胚胎中脑细胞分化，且呈剂量-效应关系。当剂量大于1.0mmol/L时，其促进作用渐减弱；当大于1.5mmol/L时，转化为抑制，IC50 是4.3mmol/L;当加入S9时，IC50 为2.3mmol/L(表2，图2)。
表2 HCY对胚胎中脑细胞分化(集落形成)的影响
| 同型半 胱氨酸 (mmol/L) | HCY+S9 | HCY | ||||
| 样本 数 | 集落数 ( ±s) | 与对照 之比率 | 样本 数 | 集落数 ( ±s) | 与对照之 比率 | |
0 | 6 | 90±7.0 | 1.00 | 6 | 90±4.0 | 1.00 |
| 0.01 | 6 | 95±7.5 | 1.05 | 6 | 96±4.0 | 1.06 |
| 0.1 | 6 | 136±4.7(2) | 1.51 | 6 | 138±12(2) | 1.53 |
| 0.5 | 6 | 154±7.1(3) | 1.71 | 6 | 152±10.2(3) | 1.69 |
| 1 | 6 | 112±5.9(1) | 1.24 | 6 | 129±10.8(2) | 1.43 |
| 1.5 | 6 | 73±12.5(1) | 0.81 | 5 | 75±13.1 | 0.83 |
| 2.5 | 6 | 37±4.0(3) | 0.41 | 5 | 62±2.9(1) | 0.69 |
| 5 | 5 | 26±4.7(3) | 0.28 | 6 | 39±5.1(2) | 0.43 |
| 10 | 6 | 1±1.5(3) | 0.01 | 6 | 4±1(3) | 0.04 |
图2 HCY对胚胎中脑细胞分化的影响
2.3 HCY对胚胎中脑细胞增殖的影响
为双相作用当HCY剂量低于1.0mmol/L时，促进增殖；当大于1.0mmol/L时，其促进作用渐减弱；当浓度为10mmol/L时，促进作用消失(表3)。
表3 HCY对胚胎中脑细胞增殖的影响(n=6,±s)
| 同型半 胱氨酸 (mmol/L) | HCY+S9 | HCY | ||
| 光密度值 ( ±s) | 与对照 之比率 | 光密度值 ( ±s) | 与对照 之比率 | |
0 | 0.143±0.018 | 1.00 | 0.146±0.009 | 1.00 |
| 0.1 | 0.164±0.011(1) | 1.15 | 0.143±0.007 | 0.98 |
| 0.5 | 0.163±0.013 | 1.14 | 0.146±0.010 | 1.00 |
| 1 | 0.208±0.031(1) | 1.45 | 0.142±0.003 | 0.97 |
| 5 | 0.169±0.015 | 1.18 | 0.141±0.002 | 0.94 |
| 10 | 0.142±0.006 | 0.99 | 0.147±0.007 | 1.01 |
3 讨论
HCY是一种含硫的氨基酸，是蛋氨酸循环的重要环节。HCY的代谢途径主要有：(1)再次甲基化生成蛋氨酸，需要N-5-甲基四氢叶酸提供甲基，N-5-甲基四氢叶酸转移酶和辅酶维生素B12 的参与；(2)转硫基与丝氨酸缩合生成胱硫醚。相关酶的遗传代谢障碍或叶酸、维生素B12 等营养物质的缺乏可使血HCY升高。流行病学调查显示母亲高同型半胱氨酸血症与NTDs及CHD的发生有相关性，但这并不能肯定两者间有因果关系。Rosenquist和李勇等人给鸡胚注射HCY诱发出了NTDs和CHD，并发现畸形发生率随HCY剂量的增加而增加[5，6] 。药代动力学实验发现，当给予鸡胚致畸剂量HCY后鸡胚血中HCY由正常的10μmol/L上升到150μmol/L，这些结果支持HCY本身就是致畸因素。但在大鼠的体外全胚胎培养中却发现低剂量的HCY(小于2mmol/L)对胚胎有保护作用，促进其发育；当剂量达4mmol/L时才表现出胚胎毒性[7] 。
本实验结果显示HCY在剂量不同时对中脑细胞增殖分化的双相作用。当HCY浓度低于1.0mmol/L时，细胞增殖、分化都呈增加趋势；当大于1.0mmol/L时，这种促进作用逐渐减弱。在分化实验中，当剂量为1.2mmol/L时已转化为抑制作用，其IC50 为4.3mmol/L。当在培养基中加入肝微粒体S9后，IC50 降至2.3mmol/L；说明HCY代谢后对细胞的分化抑制作用有所增强。在增殖实验中，当剂量是10mmol/L时，促增殖作用消失。低剂量时的促进作用可能与HCY代谢有关：(1)HCY再甲基化生成蛋氨酸，提供细胞生长必需的营养物质；(2)此过程伴随5-甲基四氢叶酸的去甲基，使四氢叶酸参与嘌呤和嘧啶的合成。本结果与Rosenquist在实验中观察到的NTDs鸡胚脊柱和脊索的增生情况相呼应，从另一个角度支持Rosenquist的推测：HCY的致畸作用可能与其生长因子样作用有关。
本实验显示了HCY对细胞分化和增殖的影响不同；当中脑细胞集落数明显减少时，对细胞增殖尚有促进作用。这说明HCY可能更多地影响了细胞间的黏附、通讯和分化，而并非直接杀死细胞；此外，我们曾用转基因技术研究了HCY诱导的新基因(HCY-2cDNA)与胚胎发育异常的关系，结果发现HCY-2编码产物可干扰胚胎细胞内在生物钟的控制功能，能使神经细胞无法进行有序的增殖和分化[8] 。这些结果均提示今后应围绕着胚胎脑细胞间的相互作用做更加深入的研究。
HCY不同于一般的外源性化学物质，是体内的正常代谢产物；随着浓度的变化，它可能对胚胞细胞产生更为复杂的影响。本实验应用大鼠为受试动物，得出半数抑制分化浓度是2.3mmol/L，高出大鼠正常HCY浓度100多倍，远远超出生理范围。但由于种群间存在差异，不同物种胚胎对同一物质的敏感性不同。如本世纪60年代的反应停曾对人类造成巨大灾难，0.5～1.0mg/kgBW即对人有致畸作用，但对大鼠和小鼠4 000mg/kgBW却无致畸作用。HCY对人胚胎细胞究竟有何作用尚无报道。作为一种新的可能的致畸因素，HCY引起了流行病学家、临床医生和毒理学家的高度重视，尚需从多角度进行深入研究。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(No.39870697)
作者简介：刘虹，女，博士生
参考文献
1，Mills J L,Scott JM,Kirke PN,et al.Homocysteine metabolism in pregnanices comlicated by neural tubedefects.Lancet,1995,345:149—151
2，Eskes TKAB.Open or closed.Eur J Obstetr Gyn Repro Bio,1998,78:169—177
3，Flint OP,Orton TC.An in vitro assay for teratogens with cultures of rat embryomidbrain and limb bud cells.Tox Appl Pharmacol,1984,76:383
4，李勇，戴修道.啮齿类动物肢芽和中脑细胞培养技术在致畸研究中的应用.中国公共卫生，1997，13(3)：185—186
5，Rosenquist TH,Ratashak S A,Selhub J.Homocysteine induces congenital defects of theheart and neural tube:effect of folic acid.Proc Natl Acad Sci USA,1996,93:15227—15232
6，李勇，李竹，陈星，等.同型半胱氨酸诱发鸡神经管畸形及叶酸的保护作用.卫生研究，1998，27(6)：372—377
7，Vanaerts LA,Blom HJ,Deabreu RA.Prevention of neural tube defects by and toxicity of L-homocysteine in cultured postimplantation rat embryos.Teratology,1994,50:348—360
8，李勇，李竹，张晨晖，等.定位转HCY-2基因诱发鸡胚神经管畸形的时间效应关系研究.卫生研究，1999，28(4)：221—223
(1999-07-14 收稿) , 百拇医药