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文章编号： 1001-0025-(2000)01-0051-04
细胞凋亡(apoptosis)是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序性死亡。它涉及一系列基因的激活、表达与调控。Fas抗原(APO-1，CD95 )及其配体(Fas ligand，Fas L)的相互作用是引起细胞凋亡的主要途径之一，它们在免疫生物学方面的效应引起了人们广泛的兴趣。在肿瘤的发病机制方面，目前认为不仅是瘤细胞无限增殖，更重要的是细胞不凋亡，才导致肿瘤的发生。多药耐药也与凋亡缺陷有关。多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是源于浆细胞的恶性肿瘤，其发病机制不清，尚不能治愈。对细胞凋亡的研究为探索MM的发病、多药耐药机制等提供了一条新的思路。
1 Fas、Fas L的基因结构、抗原分布及生物学效应
人Fas基因组DNA位于染色体10 q 23上，全长25 kb，为单拷贝基因，由8个内含子和9个外显子组成,其中外显子2～5编码Fas蛋白的膜外区，外显子6编码跨膜区，膜内区由外显子9编码。Fas基因5侧翼序列富含G/C，但没有TATA盒，存在多个转录起始位点，这与许多具生长控制作用的看家基因很相似。转录起始位点附近有大量CpG,表明Fas基因的表达可能受甲基化作用的调节。Fas基因5上游序列有两个特点，一是具有与NF-AT，GAF，NF-κB因子相同的序列，而这些因子参与了γ-干扰素(interferon-γ,IFN-γ)或肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)激活T细胞中一些基因的上调；二是存在一段富含嘧啶的序列，与鼠囊性纤维变穿膜调节基因的结构类似，后者可下调基因表达[1] 。
Fas受体属Ⅰ型跨膜蛋白，属肿瘤坏死因子/神经生长因子受体超家族成员。Fas蛋白C端在膜内有一段80个氨基酸的序列，与凋亡信号的传递密切相关，被称为“死亡功能区”。Fas为非谱系特异性抗原，可见于80%～90%活化的T、B、胸腺细胞、大部分活化的NK细胞(natural killer cells)、30%～40%静息T、B、单核细胞及5%静息NK细胞、胸腺细胞[2，3] 。Fas在Fas L或抗Fas单抗作用下交联、传导凋亡信号使细胞凋亡，参与了淋巴细胞的选择和免疫监控，在维持机体自身稳定中起负调控效应。可溶性Fas(soluble Fas,sFas)与Fas RNA剪接方式不同，前者跨膜区缺失或不完整。sFas与Fas L(或抗Fas单抗)有很高亲和力，起间接抑制凋亡的作用。
人的Fas L基因位于染色体1 q 23上，编码基因长约8.0 Kb，由4个外显子组成。Fas L 为一40 KDa的第Ⅱ类跨膜蛋白，在许多正常及肿瘤细胞上表达，而主要表达于活化的脾细胞、胸腺细胞，属于TNF家族成员。其胞外区与TNF-α、CD30 L、CD40 L、淋巴毒素有同源性，可使Fas阳性，Fas L敏感的靶细胞发生凋亡，在自身耐受及T细胞介导的靶细胞杀伤中起重要作用。
2 浆细胞肿瘤Fas的表达与凋亡
Westendorf等[4] 研究了10个MM细胞系，9个表达Fas，8个系能被Fas抗体诱导凋亡，2个细胞系对抗Fas单抗耐受，其中一系不表达Fas，另一系表达Fas，但不表现抗Fas抗体诱导的凋亡。进一步用三色流式细胞仪在15/28 MM，3/6良性单克隆免疫球蛋白病，2/7原发性淀粉样变患者浆细胞中检出Fas表达。Fas阳性的骨髓瘤细胞在骨髓单个核细胞培养中对抗Fas抗体介导的凋亡耐受。相反，同一患者纯化的浆细胞对抗Fas单抗敏感，提示在未分离的单个核细胞培养中存在一种保护因子抑制了Fas介导的浆细胞凋亡。而且，正常人和骨髓瘤患者的血清也保护骨髓瘤细胞免于Fas介导的凋亡。Hata等[5] 在5个浆细胞系中发现4个系Fas阳性，其中3个系用抗Fas单抗可诱导细胞凋亡，另一系Fas阳性而对Fas抗体抵抗。进一步研究发现，后者有bcl-2高表达，Fas抗体诱导凋亡明显的细胞系RPMI 8226为bcl-2低表达，提示bcl-2对Fas介导的凋亡有抑制作用。但bcl-2可能并不是唯一抑制Fas凋亡的因素，因KHM 18、KHM 11并不表达BCL-2，但较RPMI 8226对Fas抗体诱导的凋亡敏感性低。Shima等[6] 用流式细胞术分析5个骨髓瘤细胞系和8例新分离的MM患者的瘤细胞，除1例外均表达Fas抗原。抗Fas单抗处理后，3/5细胞系发生凋亡，U 266、Hs细胞系在Fas抗体剂量提高100倍，用INF-γ或提高温度均不发生凋亡。
综上所述，大部分骨髓瘤细胞表达Fas，但只有其中一部分对Fas抗体诱导的凋亡敏感。Fas阳性浆细胞对Fas抗体敏感性不同，可能有以下几个原因：①活化正常B细胞的刺激因素决定了这些细胞是否表达Fas和/或经历Fas介导的细胞凋亡；②不同类型细胞及同一系细胞在不同成熟阶段凋亡的阈值不同[4,7,8] 。Hata等[5] 发现Fas与晚期抗原-4(very late antigen-4，VLA4 )表达呈正相关，支持Fas凋亡与浆细胞不同分化阶段有关；③诱导B细胞产生Fas的信号与对Fas抗体反应的信号不同。而体内浆细胞对Fas抗体耐受还可能有以下原因：①不表达Fas；②存在一种保护性因子如sFas间接抑制Fas阳性瘤细胞的凋亡；③Fas抗原突变导致功能丧失[9] 。Landowski等[10] 用逆转录聚合酶链反应(reverse transcriptase polymerase chain reaction，RT-PCR)、单链构象多态性(single strand conformational polymorphism,SSCP)分析、DNA测序法，分析了54例MM患者的骨髓样本，6例(11%)未检测到Fas抗原的mRNA；48例确实检测出Fas表达，其中5例(10%)显示点突变，所有突变均位于细胞内区，2例突变与先天性自身免疫淋巴增殖综合征(congenital autoimmune lymphoproliferative syndrome，CALPS)突变位点相同，1例点突变的位置距lprcg 鼠(Fas抗原突变鼠)突变的位置仅差2个氨基酸。Frassanito等[11] 通过克隆和测序发现有Fas抗原变异或Fas cDNA缺失的骨髓瘤细胞克隆对Fas诱导的凋亡耐受。尽管这些突变的功能状态还有待于研究，我们可以推测，Fas抗原突变可能与某些MM患者的发病与病情恶化有关。因此，尽管抗Fas单抗对小鼠白细胞肿瘤治疗已获成功，但对骨髓瘤患者的治疗有待进一步研究。
3 Fas与其他凋亡相关因素
一般认为，Fas、Bax、Bcl-Xs促进凋亡，而Bcl-2、Bcl-Xl抑制凋亡[12～15] 。Egle等[16] 研究了8个骨髓瘤细胞系，均表达Bcl-2，但Bax、Bcl-X蛋白表达不同，7个细胞系表达不同水平的Fas。Fas表达水平与Bax平行，与Bcl-2或Bcl-X无关。抗Fas单抗的效果与Fas及Bax抗原有关，与Bcl-2或Bcl-X无关，且Fas诱导的凋亡不依赖野生型p53。但也有作者认为p53可将Fas作为转录激活的靶基因，上调Fas的表达[17] 。
白介素-6(interleukin-6，IL-6可通过自泌、旁泌形式刺激MM细胞生长，Chauban等[18] 研究表明，IL-6还是抑制Fas介导凋亡的一种可溶性因子，他用抗Fas单抗7 C 11诱导MM细胞系RPMI-8226、IM-9及浆细胞白血患者的细胞凋亡，此过程中C-jun早期反应基因表达增加，应激活化蛋白激酶(stress-activated protein kinase，SAPK)和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，p 38 MAPK)活化，未观察到细胞外信号调节激酶ERK 1、ERK 2(extracellular signal-regulated kinase)活性增加。用Fas单抗处理前，MM细胞与IL-6共同培养可减少DNA片段形成及降低SAPK活性，而不改变p 38 MAPK活性。这些结果提示抗Fas单抗诱导的骨髓细胞凋亡与SAPK活性有关，IL-6可调节SAPK活性而抑制凋亡。
干扰素与化疗联合治疗MM可增加患者反应率和总生存率，用于维持治疗可延长缓解时间，其作用机制尚不完全清楚。1994年Lasfar等证实，IFN-α抑制骨髓瘤细胞系RPMI 8226、U 266生长，降低瘤细胞DNA的合成。IFN是否也能促进凋亡?Egle等[19] 在5个骨髓瘤细胞系的研究中发现，IFN-α2可降低Fas单抗诱导的凋亡(虽然IFN-α 2在5个细胞系均导致中度的Fas上调)。IFN-γ也上调Fas表达，但也未影响Fas诱导的凋亡。进一步研究发现IFN-α 2通过活化蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)抑制Fas介导的凋亡。而Spets等[20] 研究发现，在骨髓瘤细胞系U-266-1970、U-266-1984、U-1958、IFN-γ和IFN-α均能明显增加Fas诱导的凋亡。预先用IFN-α或IFN-γ处理还能抑制U-266-1970和U-1958的增殖，且抑制作用呈剂量依赖性。对U-266-1984，IFN-γ能促进凋亡而无生长抑制作用。IFN能上调其中一系的Fas抗原表达而不影响Bcl-2或Bax表达。
Mariani等[21] 报告对Fas L耐受的骨髓瘤细胞，肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing tigand,TRAIL)可诱导其凋亡。在TNF家族中，TRAIL配体与Fas L同源性最高。Mariani等[21] 重组了鼠TRAIL，在感染重组体的细胞系上清中的TRAIL诱导了Fas L耐受的骨髓瘤细胞的凋亡。不可逆的白介素1β-转化酶相关蛋白酶(interleukin 1 β-converting enzyme related proteases，IRP)/Caspase抑制剂Ac-YVAD-cmk和可逆性抑制剂AC-DEVD-CH0均可阻断TRAIL诱导的凋亡，而且TRAIL介导的凋亡细胞表现多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase，PARP)的裂解能被AC-DEVD-CH0完全阻断。说明TRAIL受体触发的凋亡信号传导途径涉及IRPs/Caspases。上述结果提示，TRAIL似乎是Fas系统活性的补充。
4 从凋亡角度看骨髓瘤细胞的免疫逃逸机制
4.1 Fas和Bcl-2表达失调导致MM患者T细胞凋亡的增加
Massaia等[22] 研究47例MM患者，随着病情进展，HLA-DR阳性(活化的)T细胞数量增加，Fas表达增加，Bcl-2阳性细胞下降，而对照组静息T细胞20%～40%表达Fas，>80%表达bcl～2。在体外，用植物血凝素或抗CD 3单抗刺激正常T细胞，Fas表达上调，bcl-2下调，T细胞对凋亡敏感性增加，因而效应T细胞数量减少。
4.2 Fas L在MM细胞上的构成性表达——肿瘤诱导的抑制免疫监视机制
Villunger等[23] 用RT-PCR、Northern分析，在7个浆细胞性肿瘤细胞系发现Fas L表达，而且所测试的5个细胞系均能杀死CEM-C 7 H 2 T淋巴细胞。这种瘤细胞的细胞毒作用能被中和瘤细胞表面Fas L 的单抗2 B 4阻止。为了在细胞间信号传导水平证实Fas/Fas L系统在细胞毒效应中的作用，用表达牛痘病毒蛋白Crm A(此蛋白可抑制Caspase-1和Caspase-8，而后二者为Fas-抗Fas抗体触发凋亡的效应期蛋白)的质粒转染的2 E 8亚克隆取代CEM-C 7 H 2，作者发现，CrmA表达细胞对与之共同培养的Fas L阳性瘤细胞及抗Fas单抗耐受。用特异性检测TNF-α的酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法检测培养物上清中的TNF-α为阴性，提示骨髓瘤细胞介导的细胞毒作用与TNF-α无关。因此推测，MM患者T细胞受到反复刺激处于慢性活化状态，瘤细胞可能通过Fas L介导T细胞的杀伤。而且，活化的T细胞既可表达Fas受体，又可表达Fas配体，并通过受体与配体的结合导致活化T细胞自杀和相互间残杀[24～26] 。这样就使瘤细胞逃逸了免疫监控。Frassanito等[11] 在几个Fas-的骨髓瘤细胞克隆培养上清中发现大量可溶性Fas L，并证实含可溶性Fas L的上清对WC8细胞有杀伤作用。
肿瘤细胞使T细胞的自发凋亡敏感的原因尚不清楚，一个可能是肿瘤细胞不能提供给T细胞活化所需要的辅刺激信号，没有辅刺激信号，T细胞受体(T-cell receptor，TCR)被配体结合可能使T细胞凋亡。外源性细胞因子如白介素-2(interleukin-2，IL-2)已用于提供这种辅刺激信号，MM患者T细胞的自发凋亡可被IL-2阻止。已证实IL-2可支持bcl-2表达而发挥抗凋亡活性。MM患者高水平的血清IL-2预示长生存，可能是内源性IL-2防止了T细胞的凋亡。这为MM的治疗提供了一条新的途径。
5 Fas/Fas L系统与MM的耐药
多药耐药是MM治疗失败的重要原因。对于耐药机制，研究较多的是P糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)介导的耐药。Landowski等[27] 在含阿霉素等蒽醌类或MTX的培养基中持续培养骨髓瘤细胞系8226和T细胞白血病细胞系CEM，从而得到耐药细胞系，发现这些耐药细胞系对Fas介导的凋亡耐受，且为剂量依赖性，对凋亡的耐受程度直接与耐药水平有关。通过RT-PCR法分析提示Fas抗原表达下降在转录水平且与药物剂量平行。此时去除化疗药物可部分恢复对化疗的敏感性及Fas抗原重新表达，但这些细胞系用抗Fas抗体交联不再诱导凋亡。这些结果提示，化疗药物介导的凋亡与生理刺激下的凋亡有共同的下游效应分子。另外MM细胞暴露于阿霉素、VP-16、过氧化氢后产生剂量和时间依赖性的Bcl-2表达上调也可能继发耐药[28] 。
为了克服耐药性，1993年Morimoto等用抗Fas抗体联合白喉毒素、阿霉素或顺铂可使细胞毒性增加，协同克服肿瘤细胞对TNF、药物、毒素的耐受性，而用INF-γ预先处理靶细胞使Fas表达上调可使细胞毒性增强。AD 10是gp 170多药耐药表达细胞系，它对联合Fas抗体与阿霉素治疗敏感。
总之，Fas/Fas L介导的凋亡涉及许多其它因子，这些因子间的相互关系、信号传导途径非常复杂，目前还不能完整地联系起来。但是，对于研究MM的发病机制，MM治疗中多药耐药的克服，T细胞介导的免疫监控作用的恢复，Fas/Fas L系统无疑给我们提供了一条新的途径。
作者简介： 李振玲 (1966-)，女，主治医师
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收稿日期： 1999-10-21 ；修订日期： 1999-11-09 , http://www.100md.com