关键词：肝癌；基因治疗；IL-2体内基因转移
【摘要】 目的 研究肝癌基因治疗中的基因体内导人方法和途径。方法 采用一种携带人白细胞介素2(IL-2)cDNA的质粒型EB病毒复制子表达载体，用Wistar大鼠建立点注射、门静脉注射和肝动脉注射加阻断法模型。每种模型分裸基因和脂质体-质粒注射两组，定期行免疫组化染色检测IL-2基因的表达。结果 各组动物基因注射后3天即可见基因表达，3～7天时达到高峰，7天后开始下降。以裸基因肝动脉注射加栓塞表达效果最好。脂质体质粒注射不增加表达效率。结论 基因直接导入结合手术和介入治疗方法可应用于肝癌的临床治疗。
Study on delivery procedure and route of a plasmideukarotic expression vector with IL-2 gene in rat liver Sun Xiaoyi, Wu Zaide, Hu Junbo, et al. Department of Surgery, Tongji Hospital, Tongji Medical University,Wuhan 430030
【Abstract】 Objective To study the gene delivery procedure and routeof gene therapy in vivo for hepatocellular carcinoma. Method An Epstin-Barr virus based plasmid eukarotic expression vector carrying IL-2 cDNA was used.Three models, gene direct injection in local liver, injection through portal vein andinjection through embolized hepatic artery, were established in closed clone Wistar rats.For each model, two subgroups, injected either naked plasmid DNA or lipofectin-plasmidcomplex, were included. The expression of IL-2 gene was regularly examined immunohistochemically. Result IL-2 gene expression was observed inhepatocyties of all animals on day 3, which reached peak within 3～7 days, and wasdeclined after day 7. Injection of naked plasmid DNA through hepatic artery plusembolization obtained a best expression efficiency. Injection of liporectin-plasmidcomplex cannot increase the expression level. Conclusion Gene directdelivery in vivo combined with intervention surgery can be used to treat hepatocellularcarcinoma.
【Key words】 Hepatocellular carcinoma Gene therapy IL-2 genetransfer in vivo
我们采用一种携带白细胞介素2(IL-2)基因的质粒型真核表达载体，在正常大鼠的肝脏对基因导入方法和途径进行研究，现将结果报道如下。
材料和方法
1. 试剂与质粒的制备 质粒型真核表达载体pDR2/IL-2由本科胡俊波博士在中国预防医学科学院病毒所国家重点实验室构建并赠送。大肠杆菌DH5α由本实验室保存。实验用各种限制性内切酶分别购自B.M、Promega等公司，抗IL-2单克隆抗体工作液购自北京军事医学科学院，免疫组化染色SP试剂盒为美国Zymed公司产品，阳离子脂质体为GIBCO公司产品。质粒pDR2/IL-2扩增、筛选，大量抽提、纯化、定量和鉴定按文献[1]进行。质粒注射液的制备：(1) 裸基因注射液： 加入5%等渗葡萄糖PBS溶解质粒DNA，配制成1g/L浓度备应用。(2)脂质体包裹质粒DNA注射液： 上述质粒DNA-PBS液50 μl加入到Lipofectin 50μl中，静置30分钟，再加入等渗PBS100μl，总量为200μl。
2. 动物模型的建立及分组 本校实验动物中心提供封闭群Wistar大鼠，乙醚吸入麻醉，按注射方法将动物分为：点注射法模型(5只)，用微量注射器将质粒溶液在标记点注射，每点50μl；门静脉注射法(4只)；肝动脉注射法(显微外科操作，4只)，游离附行于门静脉上的肝固有动脉，在其与肝总动脉分叉处结扎，形成阻断。4号针穿刺肝固有动脉入肝端注入药物。以上每种模型又分裸基因和脂质体-质粒注射两组。每组动物分别在3、7、11、14天四个时间点取标本检查。
3. 基因表达的免疫组化检查 组织标本10%中性福尔马林固定，脱水、透明及包埋制成蜡块，4μm切片备免疫组化染色检测。采用Zymed过氧化酶标记的链霉卵白素免疫组化染色方法，一抗为鼠抗人IL-2单抗，按试剂盒说明书进行。
4.免疫组织化学切片分析 阳性表现为胞浆呈棕黄染色，免疫组化检测按镜检每高倍镜阳性细胞数计数，行半定量分析。+：单个肝细胞阳性；++： 点状细胞阳性(即数个肝细胞集团呈阳性)；+++：小片状阳性(指10个细胞至半个低倍视野的阳性)；++++： 大片阳性(半个低倍视野以上呈阳性)。
结 果
1. 质粒酶切鉴定 pDE2/EL-2长约11.7kb，两个BamHI位点分别在0.7和1.7kb处，其间为1kb的人工L-2cDNA序列，故用BamHⅠ酶切pDR2/IL-2表达质粒可得10.7和1.0两个片段，酶切结果与之相符；在pDR2/IL-2质粒中IL-2cDNA的C端约200～300bp处和pDR2载体质粒的多克隆位点处各有一个XbaI酶切位点，用XbaI酶切得11、0.7kb两个片段，与原基因图及酶切图对照，表明质粒及IL-2基因插入正确。
2. 各组模型所有动物的存活均达到预计取检期，并按计划取检。IL-2基因表达主要分布于细胞浆和细胞膜缘，阳性细胞主要分布于血管周围和汇管区周围。各组动物基因注射3天后即可见基因表达，一般3～7天时达到高峰，7天后开始下降，11～14天后均仅有少量表达。所有方法中，以裸基因肝动脉注射加栓塞表达效果最好。脂质体DNA注射在各组、各时间点的表达都少于裸基因注射，并常伴有肝细胞水样变性(表1)。
表1 真核质粒表达载体pDR2/IL-2在正常大鼠肝组织中的表达
| 项目 | 3天 | 7天 | 11天 | 14天 | |
| 裸基因 | ++～+++ | ++ | +～++ | +～++ | |
| 局部注射(n=5) | 脂质体/DNA | ±～+ | ±～+ | + | ± |
| 裸基因 | ++++ | ++～+++ | +～++ | + | |
| 肝动脉注射加阻断(n=4) | 脂质体/DNA | + | + | + | ±～+ |
| 裸基因 | ++ | + | - | - | |
| 门静脉注射(n=4) | 脂质体/DNA | +～++ | ±～+ | ± | - |
基因治疗的效果首先取决于治疗DNA在体内转移到相应靶细胞所选择的转移方法[2] 。根据肝脏的血供以及肝癌手术治疗的特点，我们提出在导入途径上对肝癌基因治疗的靶向性进行控制。在质粒型真核表达载体pDR2/IL-2中，pDR2是带有OriP复制子和复制所必需的EBNA-Ⅰ反式因子的EB病毒表达载体，它与传统的重组病毒颗粒型载体完全不同，本质上是一种真核细胞质粒，导入人细胞后与染色体不整合，以附加子形成复制，安全性高[3] 。其上克隆的人IL-2cDNA全序列实际上起着一种报告基因的作用，采用免疫组化的方法以相应的单克隆抗体来检测其表达和分布。
我们的研究也证实了裸基因和脂质体包裹基因肝局部注射两种方法在表达量和表达时间上基本相似。肝脏具有丰富的血管供应，经血管途径的基因导入可实现器官甚至肿瘤组织的靶向性。我们通过选择肝动脉和门静脉两种途径，在肝动脉导入基因后结扎肝动脉以模拟介入疗法中肝动脉注射加栓塞的方法。本研究结果表明这两种方法中以肝动脉注射加栓塞效果最佳，基因注射后三天在肝脏的汇管区以及血管旁的肝细胞浆内即可见广泛而丰富的IL-2的表达。相反，门静脉注射的表达效率就较低，仅可在肝组织内见到少量点状肝细胞表达，这种差别的原因可能与所选择注射血管的血流动力学有关。本研究结果显示，不论是采用肝动脉还是门静脉注射，脂质体包裹基因的表达率都不如裸基因注射，还常伴有广泛的水样变性。
质粒型表达载体直接导入方法有以下优点： (1)制备技术容易、省时间而且经济；(2)无将外源性病毒基因组导入而引起突变和感染的危险，因而更易推广在临床上应用；(3)pDR2为一种质粒型瞬时表达载体，其最高表达时间是在注射后的3～7天，可维持到至少14天时，故基因直接导入可根据治疗效果随时加以调整。这些特点如结合手术或现有已成熟的肝癌介入治疗方法使其可持续的导入，将有利于临床应用。
参考文献
1 金冬雁，黎孟枫译. 分子克隆实验指南. 第二版, 北京：科学技术出版社，1992：16-34.
2 孙晓毅，吴在德. 肝癌基因治疗中基因体内导入方法的研究.国外医学外科分册，1998，25：208-210.
3 Margolskee R F. Epstein-barr virus based expression vector. Curr Topic Microbiol Immunol, 1992, 158: 67-95.
(收稿： 1998-06-19)
, http://www.100md.com