内毒素对血管内皮细胞分泌功能的影响

http://www.100md.com 《中华实验外科杂志》 1999年第6期

刘宝华 陈惠孙 周继红 金榕宾 400042 重庆，第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所普通外科 中华实验外科杂志 1999 0 16 6
关键词：内毒素；血管内皮细胞；内皮素；一氧化氮 期刊 zhsywkzz 0 论 著 fur -->

【摘要】 目的 探讨内毒素对脐静脉内皮细胞分泌功能的影响。方法 选择体外培养的人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)为研究对象，分别用内毒素、L-左旋精氨酸和硝基左旋精氨酸进行处理，并检测上清液中内皮素1(ET-1)和一氧化氮(NO)含量。结果 内毒素使ET-1和NO含量增加；NO则使ET-1的含量降低。结论 内毒素能导致人脐静脉内皮细胞损伤，使ET-1和NO的合成和释放增加；NO则抑制ET-1的合成和释放。

Effects of endotoxin onthe secretive function of the human umbilical vein endothelial cells

LIU Baohua, CHEN Huisun, ZHOU Jihong, et al.
Research Institute of Field Surgery, Daping Hospital, Third Military Medical University,Chongqing 400042

【Abstract】 Objective To study the effects ofendotoxin on the secretive function of the human umbilical vein endothelial cells. Methods After the in vitro cultured human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) werehandled with endotoxin, L-arginine and nitric-L-arginine respectively, the contents ofET-1 and nitric oxide (NO) in supernatant were determined. Results Endotoxincould increase the synthesis and release of ET-1 and NO.NO could decrease the synthesisand release of ET-1. Conclusion Endotoxin might result in the damage ofendothelial cells, therefore the overproduction of ET-1 and NO were induced by endotoxin.NO could inhibit the synthesis and release of ET-1.
【Key words】 Endotoxin Endothelial cell Endothelin Nitric oxide

血管内皮细胞不但分泌收缩血管因子内皮素(ETs)，也分泌舒张血管因子，如一氧化氮(NO)、前列环素(PGI₂ )。我们研究内毒素对脐静脉内皮细胞(humanumbilical vein endothelial cell, HUVEC)分泌功能的影响，旨在了解内毒素对内皮细胞的损伤机理。

材料和方法
1. 人脐静脉血管内皮细胞的培养及鉴定^[1] 常规培养人脐静脉内皮细胞，调整培养的脐静脉内皮细胞浓度为1.5×10⁵ ～2×10⁵ 个/ml，培养5～10天后，脐静脉内皮细胞融合在一起，倒置显微镜下观察，发现培养的脐静脉内皮细胞呈铺路石状相嵌单层排列。抗辣根过氧化酶法(PAP)检验Ⅷ因子相关抗原。
2. 分组 将培养已融合的脐静脉内皮细胞分为以下各组：(1)正常对照组；(2)内毒素致伤A组：加入内毒素使得其终浓度为100mg/L；(3)内毒素致伤B组：加入内毒素使得其终浓度为50mg/L。(4)内毒素和左旋精氨酸组：50mg/L内毒素和1×10^-5 左旋精氨酸；(5)内毒素和硝基左旋精氨酸组：50mg/L内毒素和1×10^-5 左旋精氨酸。上述各组在加入处理因素1、3、6、12小时后，收取培养液，留取标本，-30℃贮藏，待测。
3. 测定指标及方法 内皮素1的测定：培养液1ml加入30μl10%EDTA二钠和40μl(400U)的抑肽酶，混匀，3000r/min离心10分钟，取上清，-70℃保存备用。应用放射免疫法测定ET-1含量，药盒由解放军总医院提供。
4. NO₂ ^- /NO₃ ^- 含量的测定 参照Hegosh和Shiloah的方法^[1] ，略加改进，检测镉柱的还原率。取细胞培养上清液1ml，加入30%ZnSO₄ 溶液，混匀，3000r/min离心10分钟，取上清过柱、洗脱、测定，以NaNO₃ 为标准。由于NO₂ ^- 含量极少，因此，一般均以NO₂ ^- /NO₃ ^- 表示。
5. 统计学处理 所有数据以均数±标准差(±s)表示，用t检验进行统计学分析。

结果
1. 内毒素对HUVEC合成ET-1的影响 50mg/L内毒素使ET-1含量升高，3小时为对照组的31.1倍，明显高于对照组(P<0.01)，次后各时相点也明显高于对照组(P<0.01)。100mg/L内毒素使ET-1活性明显高于对照组，3、6小时时相点则显著高于内毒素B组(P<0.05，表1)。ET-1的含量与内毒素的浓度在一定范围内呈依赖关系，随内毒素浓度增加，ET-1的含量升高。

表1 内毒素对HUVEC合成ET-1的影响(pg/10⁵ cells^. ml^-1 ,±s)

注：与对照组相比^** P<0.01；与内毒素B组相比^# P<0.05

2. NO对HUVEC合成ET-1的影响 内毒素(50mg/L)和NO合成抑制剂硝基左旋精氨酸同时给予时，ET-1的含量明显高于对照组(P<0.01)，1小时高于内毒素组(P<0.05)。内毒素(50mg/L)和NO合成底物左旋精氨酸同时给予时，ET-1的含量虽然明显高于对照组(P<0.01)，但1、12小时显著低于内毒素组(P<0.01，表2)。

表2 NO对HUVEC合成ET-1的影响(pg/10⁵ cells^. ml^-1 ，±s)

注：与对照组相比^{* *} P<0.01；与内毒素B组比^# P<0.05，^{# #} P<0.01

3. 内毒素对HUVEC合成NO的影响 内毒素对HUVEC的NO合成有明显的刺激作用，各时限点NO₂ ^- /NO₃ ^- 含量均显著高于对照组(P<0.01，表3)。

表3 内毒素对HUVEC合成NO₂ ^- /NO₃ ^- 的影响
(μmol/10⁵ cells^. ml^-1 ,±s)

注：与对照组比^{* *} P<0.01

4.内毒素B组ET-1与NO的比值 ET-1与NO比值呈逐渐下降趋势，表明ET-1升高时相点在前，NO明显增高在ET-1之后。ET-1与NO比值在各时相点均高于对照组(表4)。

表4 内毒素B组ET-1与NO的比值

讨论
ET-1的合成和释放受许多因素的影响，包括内环境的理化因素、细胞因子、舒张血管因子等。用内毒素脂多糖处理内皮细胞1小时后，上清ET-1含量急剧增加，3小时达最高峰，说明内毒素对血管内皮细胞有直接损伤作用，导致血管内皮细胞合成和释放ET-1增加。本实验结果表明，内皮细胞在正常情况下合成少量的NO，可能对于维持内皮细胞功能的稳定具有一定的作用。用内毒素脂多糖处理内皮细胞后，上清的NO₂ ^- /NO₃ ^- 含量急剧增加，说明内毒素可直接导致内皮细胞合成和释放NO，内毒素对原生型一氧化氮合成酶(cNOS)无刺激作用，但可刺激单核吞噬细胞，诱导诱生型一氧化氮合成酶(iNOS)的大量表达，使NO生成增多。ET-1和NO比值表明，内毒素脂多糖处理内皮细胞后，ET-1升高较NO升高更加明显，可能说明在病理情况下，ET-1的分泌相对增多，导致血管收缩，组织血流量降低。

注： 本课题为全军重点实验室课题

参考文献
1 安静.胎儿脐静脉内皮细胞培养.第三军医大学学报，1990，12：120-121.

(收稿：1999-05-10) , http://www.100md.com

    百拇医药网 http://www.100md.com/html/DirDu/2005/07/04/66/96/59.htm