肝纤维化实质是Ⅰ、Ⅲ型为主的胶原纤维等细胞外基质(extracellular matrix, ECM)合成与降解失衡，在肝内过度沉积而形成的病理性疾病。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)是一组参与降解ECM的主要水解蛋白酶，目前肝内发现了8种，其中间质胶原酶(interstitial collagenase, MMP-1 in human, MMP-13 in rat)主要参与Ⅰ、Ⅲ型胶原的降解，与肝纤维化的发生发展紧密相关^[1] 。既往研究表明，肝损伤或肝纤维化早期间质胶原酶活性常升高，但随着肝纤维化发展到中晚期直至肝硬化阶段，其活性进行性下降，ECM降解水平也明显下降^[2] 。其原因可能是酶原合成减少或激活受到抑制以及其抑制因子的作用。为了了解肝纤维化过程中MMP-13酶原蛋白表达是否呈相应变化，我们应用Western blot方法对CCl₄ 中毒性大鼠肝纤维化模型肝内MMP-13酶原蛋白的表达水平变化作了检测，现报道如下。

一、材料
清洁型Wistar雄性大鼠120只，体重200～300克，第一军医大学实验动物中心提供。Bio-Rad蛋白抽提及定量试剂盒为Bio-Rad产品；MMP-13兔多克隆抗体由美国(NIH) Stevenson惠赠；辣根过氧化物酶标二抗(羊抗兔IgG-HRP),SABC产品。电转膜仪为Bio-Rad公司产品；图像分析系统为Gel Documentarion Analysis System (GDAS)。
二、方法
(一) 模型制备：参照Montfort等^[2] 方法，体积分数为40%CCl₄ 花生油溶液按0.2ml/100g体重予Wistar大鼠腹腔内注射，每周两次，共12周。120只大鼠分模型组70只和对照组50只(用相应量生理盐水腹腔注射)。在0、2、5、7、9、12、14周时每组分别活杀7～10只，切取肝脏，除留作常规HE染色外，其余迅速投入液氮，之后转入-70°C保存。
(二) 蛋白质的提取及定量：参考Bio-Rad试剂盒说明书进行，并根据各个样品蛋白质A₅₉₅ 值的差异行标准化处理。
(三) 蛋白的变性：取等量标准化后的蛋白溶液加入等体积的2×SDS上样缓冲液并沸水煮约10min，使蛋白变性。
(四) Western印迹^[3] ：取等量变性后的标准化蛋白溶液，进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，每孔上样量为25μl，并以电转膜仪将蛋白转移至硝酸纤维素膜(90mA,1小时)，经丽春红S染色鉴定并标记标准蛋白位置，再以5%脱脂奶粉封闭、一抗及二抗温育、DAB显色。
(五) 结果分析定量：硝酸纤维素膜显色条带为相对分子质量54 000的MMP-13酶原蛋白，对结果扫描定量分析。

正常大鼠肝内有MMP-13的酶原蛋白表达，整个实验过程中正常对照组和模型组MMP-13酶原蛋白表达差异均无显著性，模型组与正常对照组相比差异亦无显著性(见表1)。

MMPs的活性变化与酶原表达、酶原的活化以及金属蛋白酶组织抑制因子(tissue inhibitors of metalloproteinase, TIMPs)的作用有关。本实验研究表明间质胶原酶在正常肝组织有表达，肝纤维化发生、发展、形成过程中及肝硬化阶段(14周左右)其酶原蛋白表达水平变化差异无显著性。另外，有研究证实^[4] 在肝纤维化过程中TIMPs表达逐渐增强，到肝硬化阶段到达最高峰。可见，间质胶原酶在肝纤维化过程中的活性变化不是其酶原蛋白表达水平变化造成的，而是与TIMPs的抑制作用和酶原活化过程有关。导致肝纤维化早期MMP-13活性有所升高的主要原因可能是酶原活化过程相对加强，随着肝纤维化的发展，TIMPs的进行性升高使间质胶原酶活性下降，造成肝损伤后增生的ECM成分尤其是Ⅰ、Ⅲ型胶原降解减少，沉积增多，从而促进了肝纤维化乃至肝硬化的形成。

参考文献