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关键词：7型腺病毒；克隆；序列分析
【摘要】 目的 获得7型腺病毒疫苗株DNA左侧0～17.5 mu片段克隆，分析0～4.8 mu片段(末端倒置重复序列、包装信号位点和Ela区)核苷酸序列。方法 从Ad7疫苗株感染的A549细胞提取Ad7 DNA，将其0.3～17.5 mu片段克隆到质粒pAd7T，并用自动和银染方法测序。结果 获得了Ad7疫苗株左侧17.5 mu片段克隆，测定了左侧1 737 bp核苷酸序列，其中Ela区所编码的6 300、24 000、28 000等3个蛋白的DNA序列，与Gomen株的同源性分别为98.9%、97.3%和97.5%，推导编码氨基酸的同源性分别为96.6%、96.5%和96.9%。这3个蛋白与Grider株的同源性分别为100%、99.7%、和99.7%；推导编码氨基酸的同源性分别为100%、99.1%和99.2%。结论 Ad7疫苗株左侧1 738 bp核苷酸与Ad7Gomen株和Grider株相应片段，具有高度的同源性。
Cloning of 0～17.5 mu and sequencing of 0～4.8 mu of the lefe end DNA of the Ad7 vaccine strain left end SHI Changxin, LIU Yang, WEN Leying, et al. Institute of Virology, Chinese Academy of Preventive Medicine, Beijing 100052
【Abstract】 Objective Cloning of 0～17.5 mu DNA fragment of adenovirus 7 vaccine strain and sequencing of 0～4.8 mu fragment(1 737 bp).Methods Isolating and purifying Ad7 vaccine genome from the A549 cultured cells, putting 0.3～17.5 mu fragment into pAd7T plasmid, then sequencing the 0～4.8 mu fragment including inverted terminal repeats (ITR), packaging sequence and Ela region.Results We obtained 0～17.5 mu fragment of Ad7 vaccine strain genome and sequenced its left terminal 1 737 bp. Sequence analysis showed that the Ad7 vaccine strain Ela region encodes 6 300, 24 000 and 28 000 proteins. Compared with equivalent region of Ad7 Gomen strain, they share the homology of the nucleotide sequence 98.9%, 97.3%, 97.5% and the homology of the deduced amino acid sequence 96.6%, 96.5%, and 96.9% respectively. When compared with Ad7 Grider strain, they share the homology of the nucleotide sequence100%, 99.7%, 99.7% and the homology of the deduced amino acid sequence 100%, 99.1%, and 99.2% respectively.Conclusion The Ad7 vaccine strain left terminal 1 737 bp nucleotide sequence showed a high homology with corresponding region of Ad7 Gomen strain and Grider strain.
【Key words】 Adenovirus type 7 Cloning Sequence analysis
Ad7做为口服活疫苗在美军新兵中使用，已有30多年的历史。由于它安全、可靠，并可在肠道里繁殖等特性，使其有可能被用来做为人类基因工程疫苗的载体，其核苷酸一级结构的阐明是构建载体的重要基础。腺病毒左侧4.6 mu片段，含有腺病毒末端重复序列、包装信号位点和Ela蛋白编码序列。末端重复序列负责腺病毒DNA复制的起始，包装信号位点负责将病毒DNA包装入病毒的壳内。Ela蛋白是腺病毒感染细胞后第一个转录的蛋白，它对于腺病毒在机体内的繁殖十分重要。它能激活Ela本身的启动子和腺病毒其他早期启动子，还能激活多个细胞因子的启动子，抑制细胞和病毒的增强子(包括Ela增强子)，诱导细胞转化，诱导细胞进入S期。缺乏Ela的腺病毒在机体内不能繁殖。我们对Ad7疫苗株左侧4.8 mu片段核苷酸序列进行了分析。
1 材料和方法
1.1 质粒和菌株 pAd7T由周杰昊等[1] 构建。菌株DH5由我所形态室保存。
1.2 细胞和毒种 Ad7疫苗株，由美国Wyeth公司洪博文教授惠赠，A549细胞由我所形态室保存，常规培养。
1.3 病毒DNA提取 参照文献[2]进行。
1.4 分子克隆技术 参照文献[3]进行。
1.5 质粒构建 SacⅠ+SacⅡ酶切pAd7T质粒，回收Ad7 97.4～100 mu片段，T4 DNA聚合酶削平。SifⅠ酶切pGEM-11zf, T4 DNA聚合酶削平。连接两者，获得重组质粒pGEM-11ZfAd7 97.4～100 mu, 命名为pAd7T。SalⅠ酶切Ad7 DNA回收0～17.5 mu片段，HpaⅠ酶切所回收的片段。SalⅠ+HpaⅠ酶切pAd7T, 回收大片段，连接大片段和Ad7 0.3～17.5 mu片段。
1.6 核苷酸序列分析 应用银染方法和自动测序方法进行，所测序列经两种方法各测1次证实，自动测序使用ABI377序列分析仪，由赛百盛生物工程公司完成。载体为PGEM11Zf(+)。测序过程中除使用通用引物外，还合成下列引物：Ad7LM-1: 5′-GAAATACTGGAGTTTGTGG-3′；Ad7LM-2：5′-TTTGCTATATGAGAATGC-3′；aD7LM3: 5′-AGTCGCGGGCCTTTGGAAT-3′。
1.7 数据处理 应用Winstar DNA序列分析软件进行。
2 结果
2.1 Ad7疫苗株左侧17.5 mu片段的克隆 腺病毒的DNA含有末端倒置重复序列，Ad7的末端例置重复序列长度为136 bp，右侧末端DNA序列分析表明，在末端例置重复序列内(99.7 mu)有HpaⅠ酶切位点[1] ，同样左侧0.3 mu处也存在HpaⅠ酶切位点，利用这一特点，将0.3～17.5 mu片段克隆到质粒pAd7T上，获得了Ad7疫苗株0～17.5 mu片段的克隆。
2.2 共测得Ad7疫苗株左侧核苷酸1 738 bp(图1)，与Ad7 Gomen株[4] 相应区段的核苷酸同源性为97.8%。与Ad7 Grider株[5] 相应区段的核苷酸同源性为99.8%。腺病毒E1区DNA在转录时发生拼接，因此无法根据其DNA的一级结构推测其编码的蛋白。与Gomen株[4] 相比较，E1A的转录物经过拼接后所产生的3个mRNA的编码部位都存在。编码6 300、24 000和28 000蛋白的DNA序列，与Gomen株的同源性分别为98.9%、97.3%和97.5%，推导编码氨基酸的同源性分别为96.5%、96.5%和96.0%。这3个蛋白与Grider株的同源性分别为100%、99.7%和99.7%，推导编码氨基酸的同源性分别为100%、99.1%和99.2%。在转录24 000和28 000的蛋白时，其终止密码子在Ad7疫苗株为TGA，和Grider株相同，而在Gomen株为TAA。Ela和TATA盒和Poly A插入信号位点与Gomen株和Grider株完全相同。在1 231 bp处疫苗株和Grider株比Gomen株多1个T。在95～99位核苷酸存在HpaⅠ酶切位点，Grider株在同样位置也存在这一位点，而Gomen株不存在这一酶切位点(表1)。
表1 Ad7v、Ad7p(Gomen)和Ad7h(Grider) Ela区核苷酸及
推导氨基酸序列同源性比较
Tab.1 Comparison of nucleotide and predicted amino acid
sequences of Ela ORFs among Ad7v(vaccine)、
Ad7p(Gomen) and Ad7h(Grider)
| Ela ORF | 核苷酸同源性 Nucleotide homdogy | 氨基酸同源性 Amino acid homology | ||
| 7 v/7 p | 7 v/7 h | 7 v/7 p | 7 v/7 h | |
| 6 300 | 98.9 | 100 | 96.6 | 100 |
| 24 000 | 97.3 | 99.7 | 96.5 | 99.1 |
| 28 000 | 97.5 | 99.7 | 96.9 | 99.2 |
周杰昊等[1] 构建了Ad7疫苗株10.8～100 mu基因文库，左侧17.5 mu片段克隆的获得，标志着Ad7疫苗株全基因文库构建的完成，为进一步完成Ad7疫苗株核苷酸全序列打下了基础。腺病毒DNA基因组的末端结合着末端蛋白，经蛋白酶处理不能将其去除完全，因此，腺病毒DNA末端的克隆比较困难，传统的方法是碱变性方法，该方法较难掌握；在序列已知的条件下可用PCR方法进行克隆[1] 。本实验利用右侧末端克隆和0.3 mu处的HpaⅠ位点，完成了左侧末端的克隆，核苷酸序列分析证实克隆正确。
Ad7疫苗株左侧1 738 bp与Ad7 Gomen株和Grider株具有高度的同源性，所编码的Ela 3个蛋白也具有高度的同源性，但Ad7疫苗株与Grider株的同源性大于与Gomen株的同源性。和Grider株相比，1 738个核苷酸仅有2个发生了突变，而与Gomen株相比则有22个核苷酸发生了突变。在1 231 bp的位置Ad7疫苗株和Grider株比Gomen株多1个T，虽然这一位置不参与有关蛋白的编码，但它说明Ad7疫苗株和Grider株十分接近。
Ad5左侧194～358 bp是腺病毒的包装信号位点[6] ，在Ad7疫苗株的左侧未能找到同源序列，腺病毒的包装信号可能与DNA序列的二级结构关系更密切。利用腺病毒的包装信号位于其DNA左侧末端几百个碱基以内的特点，近年来构建了缺失腺病毒全部编码基因的载体[7～10] ，这一新型的腺病毒载体，在基因治疗研究领域有极其广阔的应用前景。我们在获得Ad7疫苗株右侧末端克隆及序列分析的基础上，又获得了左侧末端克隆及序列分析，为进一步构建缺失全部结构蛋白编码基因的腺病毒载体，提供了必要的基因元件。
图1 Ad7疫苗株0～4.8 mu片段核苷酸序列
Fig.1 Nucleotide sequence of Ad7 vaccine strain 0～4.8 mu fragment
本文受国家863计划资助(项目编号：102-07-02-06)
参考文献
[1]周杰昊，屈建国，石长信，等.7型腺病毒疫苗株基因克隆及其右侧末端SmaⅠH片段的核苷酸序列分析.中华实验和临床病毒学杂志，1998，12(1)：23-26.
[2]Graham F L, Prevec L. Methods for construction of adenovirus vectors. Molecular Biotechnology, 1995, 3:207-220.
[3]J.萨姆布鲁克，E.F.弗里奇，T.曼尼阿蒂斯著.金冬雁，黎孟枫，译.分子克隆实验指南.北京：科学出版社，1992.
[4]Dijkema R, Dekker B M M, Van Ormondt H, et al. Gene organization of the transforming region of weakly oncogenic adenovirus type y: the Ela region. Gene, 1980, 12:287-299.
[5]Heysen A, Verwaerde P, D′Halluin J C. The nucleotide sequences of the transforming Hind Ⅲ-Ⅰ, J fragments of adenovirus type 7 DNA. Tumor Res, 1984, 19:34-47.
[6]Grable M, Hearing P. Cis and trans requirements for the selective packaging of adenovirus type 5 DNA. J Virol, 1992, 66:723-731.
[7]Mitani K, Graham F L, Thomas C C, et al. Rescue, propagation, and partial purification of a helper virus-dependent adenovirus vector. Proc Natl Acad Sci USA, 1995, 92:3854-3858.
[8]Fisher K J, Choi H, Burda J, et al. Recombinant adenovirus deleted of all viral genes for gene therapy of cystic fibrosis. Virology, 1996, 217:11-22.
[9]Kochanek S, Clemens P R, Mitani K, et al. A new adenovirus vector: replacement of all viral coding sequences with 28 kb of DNA independently expressing both full-length dystrophin and galactosidase. Proc Natl Acad Sci USA, 1996,93:5731-5736.
[10]Parks R, Chen L, Anton M, et al. A helper-dependent adenovirus vector system: removal of helper virus by cre-mediated excision of the viral packaging signal. Proc Natl Acad Sci USA, 1996,93:13565-13570.
(收稿：1998-09-09 修回：1998-12-17)
, 百拇医药