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关键词：
在基因治疗研究中，80%左右采用逆转录病毒作为基因载体，由于逆转录病毒整合至靶细胞具有选择性，所以如何提高其转导效率便成为许多研究者关注的焦点，并从转导技术方面作了不少探讨。本文报告在进行细胞内免疫抗乙型肝炎病毒(HBV)基因治疗研究中，应用4种不同转导条件，对基因转导效率进行比较的结果，以探讨既有实用价值，又能获得满意的转导效率的方法。
1 材料和方法 图1 表达HBC/SFV的逆转录病毒载体结构
1.1 细胞培养 2株含抗HBV核心抗原单链抗体基因(HBcSFV)的包装细胞系pA317，NIH3T3和人肝癌细胞系Hep3B，均培养于含10%小牛血清的DMEM培养液(GIBCO，BRL)，置37℃，5%CO2 中。
1.2 包装细胞系的建立 本研究所用的逆转录病毒载体为LNSX和LNCX[1] 。HBc/SFV基因重组质粒为本室构建(图1)。
Fig.1 Structure of the retrovirus vector expressing HBC/SFV
分别使用上述2种重组基因质粒，采用磷酸钙共沉淀法转染至pA317，操作按试剂盒推荐的方法进行(Promega)，次日换液后加入800 μg/mlG418筛选2周，每株细胞挑取8～10个单克隆，分别传代培养并进行包装病毒滴度(CFU)测定(方法略)。
1.3 转导条件 各挑取一株(LNSHBc和LNCHBc)高滴度病毒颗粒的单克隆包装细胞系pA317, 其病毒滴度分别为1.7×107 和2.0×107 ，以NIH3T3和Hep3B细胞为靶细胞，以1×104 /每孔细胞密度接种于6孔培养板，加入1.5 ml培养液，每一转导均加入0.5 ml包装细胞上清。分别应用32℃和37℃2种条件培养包装细胞，并在相同温度下进行转导。转导结束后，均改用常规37℃继续培养，次日以1∶1稀释至10 cm培养皿，并加入800 μg/mlG418筛选2周，结晶紫染色后计算克隆形成数，以下述方法3的克隆数作为100%，计算转导效率。采用下列不同转导方法。
方法1：为常规使用的转导方法，在2种不同温度下加入8 μg/ml Polybrene辅助转导，24小时后换液，加入800 μg/mlG418筛选。方法2：转导方法同1，每日换取新鲜包装细胞上清，连续转导3天，第4日加入800 μg/ml G418筛选。方法3：加入包装细胞系上清后，分别在32℃和37℃条件下离心2 500转/分，90分钟，同等条件下继续培养，次日加入800 μg/ml G418筛选。方法4：靶细胞选用终浓度为5 mmol/L的氯化钙处理30分钟，室温，再加入包装细胞系上清，次日换液后加入800 μg/ml G418筛选。
2 结果
应用4种不同方法转导NIH3T3和Hep3B细胞，经G418筛选后，计算克隆形成数和转导效率(表1)。
表1 4种不同方法基因转导克隆形成数和转导效率比较(%)
Tab.1 Efficiency of transduction with four protocols
| 温度 Temp | 方法1 Protocol 1 | 方法2 Protocol 2 | 方法3 Protocol 3 | 方法4 Protocol 4 | ||||
| 3T3 | Hep3B | 3T3 | Hep3B | 3T3 | Hep3B | 3T3 | Hep3B | |
| 32℃ | 220 | 174 | 661 | 513 | 670 | 543 | 465 | 370 |
| (32.8) | (32.0) | (98.7) | (94.5) | (100) | (100) | (69.4) | (68.1) | |
| 37℃ | 169 | 132 | 492 | 374 | 500 | 398 | 402 | 343 |
| (33.8) | (33.2) | (98.4) | (94.0) | (100) | (100) | (80.4) | (86.2) | |
在4种不同方法中，应用32℃培养包装细胞和转导，其效率优于37℃条件，离心法和连续3天转导法高于其他2种方法，氯化钙辅助法虽高于常规Polybrene转导方法，但缺乏临床应用价值。应用的2种不同载体之间，转导效率无明显差异。
3 讨论
基因转导效率的高低是决定基因治疗效果的关键因素之一，所以不少研究者就如何提高基因转导效率进行技术方法上的探讨。Kotani等[1] 应用不同温度培养包装细胞以增加病毒包装颗粒的稳定性，Bunnell等[2] 辅以离心法，也可提高转导效率，Morling等[3] 采用氯化钙辅助法，可使转导效率提高5～50倍，我们在参考文献报告改进转导方法的基础上，从临床应用和简便有效出发， 采用连续3天转导，每日更换新鲜包装病毒，在Polybrene的辅助下，可以取得满意的转导效率，与离心法比较无明显差别，明显优于其他2种方法，也无需特殊设备。连续3天转导和每天更换新鲜包装细胞上清，可以使包装病毒颗粒处于较好的活性状态，这一方法适合于贴壁和悬浮培养的细胞。我们认为决定转导效率主要有三个方面的影响因素；①靶细胞状态，同一种方法在不同类型靶细胞的转导效率不一；②转导方法；③包装细胞的病毒滴度和病毒颗粒的质量。
本课题受国家自然科学基金(编号：3967067)和全军医药卫生科研基金(编号：96M70)资助
参考文献
1 Kotani H, Newton PB, Zhang SY, et al. Improved methods of retroviral vector transduction and production for gene therapy. Hum Gene Therapy, 1994, 5:19-28.
2 Bunnell BA, Muul LM, Donahue RE, et al. High efficiency of retroviral-mediated gene transfer into human and nonhuman primate peripheral blood lymphocytes. Proc Natl Acad Sci USA, 1995, 92:7739-7743.
3 Morling FJ, Russell SJ. Enhanced transduction efficiency of retroviral vector coprecipitated with calcium phosphate. Gene Therapy, 1995, 2:504-508.
(收稿：1998-05-25 修回：1998-11-16)
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