关键词：肝炎病毒；丙型；基因；病毒；序列分析；干扰素α
【摘要】 目的 观察丙型肝炎患者丙型肝炎病毒(HCV)1b型基因组部分NS5 A区核苷酸、氨基酸的变异情况并探讨其与α干扰素疗效的相关性。方法 患者干扰素治疗前、中、后留血标本，用聚合酶链反应(PCR)扩增HCV病毒NS5 A区部分基因片段，并用直接测序法测序。与HCV-J株及HCV-河北株(HCV-HB)比较核苷酸及氨基酸序列的同源性，根据α干扰素疗效分析HCV1b是否存在干扰素敏感决定区。同时分析干扰素治疗是否对HCV基因组变异有影响。结果 患者的HCV NS5 A区核苷酸序列比较保守，与HCV-J及HCV-HB相比，同源性分别为98.22%和98.43%，推导的氨基酸序列2 209-2 248极少有变异。18例患者经α干扰素治疗，仅4例有效。疗效与氨基酸变异无明确相关。结论 HCV1b型NS5 A区核苷酸及氨基酸序列高度保守，目前并未证实存在干扰素敏感决定区。干扰素治疗加速HCV NS5 A区核苷酸变异，但对氨基酸变异影响不大。
Analysis of genome character and amino acid residues 2 209 to 2 248 of NS5 A region of hepatitis C virus in relation to the response to interferon therapy
DUAN Xuezhang, ZHU Chuanlin, CHENG Yun, et al.
Department of Immunology, 302 Hospital of PLA, Beijing 100039
【Abstract】 Objective To observe nucleotide sequence variations and amino acid residues 2 209 to 2 248 of the NS5 A region of hepatitis C virus in relation to interferon therapy in Chinese patients infected with HCV genotype 1b.Methods We collected sera from 22 patients infected with HCV genotype 1b, performed nested RT-PCR using extracted serum RNA from sera, amplified NS5 A region 2 209 to 2 248 and sequenced the PCR product directly. The deduced amino acid sequences were compared with the corresponding region of the HCV-J prototype strain. Results Only 4 isolates were intermediate type, and no mutant type was found. In 18 patients treated with IFN-α, only 4 were HCV RNA negative at present, No correlation was found between amino acid mutation and IFN response.Conclusion Variations in the NS5 A region between amino acid residues 2 209 to 2 248 failed to predict IFN response in Chinese patients infected with HCV genotype 1b. IFN may accelerate nucleotide variation but has little influence on amino acid variations.
【Key words】 Hepatients C virus Gene, viral Sequence analysis Interferon-alpha
丙型肝炎病毒感染后慢性化率极高，临床上常导致慢性肝炎、肝硬变甚至肝癌。干扰素是目前唯一有效的治疗手段，但治愈率低。中国人丙型肝炎患者主要以1b、2a型为主，而北京地区1b型比例更高，约在80%～90%[1] 。故研究HCV1b型病人基因组变异与干扰素疗效关系对控制临床用药、指导临床治疗有重要意义。日本学者发现HCV1b型NS5 A区2 209-2 248位氨基酸序列变化与干扰素疗效有相关性[2，3] 。他们认为氨基酸序列与HCV-J相同者为野生株，对干扰素治疗不敏感；氨基酸序列变异在1～3个之间的为中间型，对治疗的敏感性也较差；而氨基酸序列变异≥4个的为突变株，对干扰素治疗敏感。故将NS5 A区氨基酸2 209-2 248位称为干扰素敏感决定区。Chayama等[4] 对103个患者研究发现，突变型对干扰素治疗反应的有效率为74%，而野生型仅为12%，中间型为24%。但Zemzem[5] 和R T Chung等[6] 不这样认为。本文拟研究中国人丙型肝炎患者HCV1b型NS5 A区的核苷酸及氨基酸序列变异情况，并确定干扰素敏感决定区是否能预测干扰素疗效。
1 材料和方法
1.1 标本来源 1997～1998年解放军302医院住院的丙型肝炎患者，经第2代酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗-HCV，PCR法检测5′NCR区，同时Simmond基因分型，前两者阳性且分型为1b型者22例作为研究对象，其中2例为急性肝炎，20例为慢性，分型全部符合1995年全国第五次传染病寄生虫病学术会议制订的诊断标准。其中18例经α干扰素治疗，300万单位，隔日1次，疗程6个月。治疗前、中、后留血清，-70℃保存。治疗效果分为无效(用药期间HCV RNA持续阳性，ALT异常)、暂时反应(Transient reaction, TR, 用药开始HCV RNA转阴，ALT下降，停药6个月以内HCV RNA转阳)、持续反应(Sustained reaction, SR, 停药6个月以上肝功正常，HCV RNA阴性)、复发(停药后ALT异常，HCV RNA转阳)。
1.2 引物设计与合成 参考HCV-J、HCV-BK、HCV-T及HCV-HB株，选取NS5 A区氨基酸2 209-2 248两侧保守区设计，由军事医学科学院2所设计合成，序列如下：HCVF1，5′-TTGGCCAGCTCTTCAGCTAGC-3′(Nt6 921-6 936); HCVR1，5′-CCAGGACTCTAGCAGT
GGAG-3′(Nt7 211-7 232). HCVF2，5′-TCAGCTAGCCAATTGTCTGC-3′(Nt6 933-6 952). HCVR2, 5′-CAGT
GGAGGGTTGTAGTCTG-3′(Nt7 200-7 220)。F1、R1为外引物，F2、R2为内引物。
1.3 主要试剂 二氧化硅，5×RT缓冲液，AMV逆转录酶，Rnasin,Taq酶，琼脂糖，聚丙烯酰胺凝胶，fmoLTM DNA sequencing system，以上试剂均购自Promega公司，Advantage PCR-pure kit clotech公司。32 P及35 SdATP购自亚辉生物公司。
1.4 HCV RNA提取扩增及纯化 采用改良的二氧化硅吸附法提取血清中病毒RNA，经无水乙醇洗涤真空抽干后加入30 μl逆转录液，包括5×buffer 6.0 μl, dNTPs 1 μmol/L , 1 μmol/L HCV 1R引物，20U RNAsin, 5U AMV。充分混匀后42℃水浴60 min，离心，取cDNA模板5 μl加入20 μl第1轮PCR反应液，包括10×Taq buffer 2.5 μl, 1.5 mmol/L MgCl2 ，2 μmol/L HCV 1F、1R引物，1U Taq酶。加50 μl石蜡油封闭。在AG 9 600 DNA扩增仪行PCR扩增：95℃1 min, 55℃1 min, 72℃1 min, 共30个循环。第1次PCR结束后取2.5 μl产物加入第2轮PCR液22.5 μl中，包括10×Taq buffer 2.5 μl, 1.5 mmol/L MgCl2 , 4 μmol/L dNTPs, 0.2 μmol/L HCV 2F、2R引物，1U Taq酶，PCR循环同上。扩增结束后取第2次PCR产物用1.5%琼脂糖电泳检测。EB染色，扩增片段为280 bp左右。
1.5 序列测定 用Advantage PCR-pure kit纯化，以纯化产物为模板用sanger双脱氧链末端终止法在LKB测序仪上测序，读取序列。
2 结果
2.1 HCV1b型NS5 A区核苷酸及氨基酸序列分析 22例患者HCV NS5 A区核苷酸序列分析见表1。
表1 22例患者HCV NS5 A区核苷酸变异位点及变异率
(与HCV-J及HCV-HB比较)
Tab.1 Nucleotide variations of HCV NS5 A region in 22
patients infected with HCV genotype 16
(compared with HCV-J and HCV-HB)
| 患者 编号 No. Cases | 核苷酸变异数 Nucleotide variation | 核苷酸变异频率(%) Nucleotide variation rate | ||
| 与HCV-J 比较 Compared with HCV-J | 与HCV-HB 比较 Compared with HCV-HB | 与HCV-J 比较 Compared with HCV-J | 与HCV-HB 比较 Compared with HCV-HB | |
1 | 4 | 3 | 1.43 | 1.07 |
| 2 | 3 | 3 | 1.07 | 1.07 |
| 3 | 5 | 5 | 1.79 | 1.79 |
| 4 | 5 | 5 | 1.79 | 1.79 |
| 5 | 4 | 2 | 1.43 | 0.71 |
| 6 | 4 | 2 | 1.43 | 0.71 |
| 7 | 7 | 6 | 2.50 | 2.14 |
| 8 | 10 | 12 | 3.57 | 4.29 |
| 9 | 6 | 4 | 2.14 | 1.43 |
| 10 | 7 | 7 | 2.50 | 2.50 |
| 11 | 7 | 6 | 2.50 | 2.14 |
| 12 | 7 | 7 | 2.50 | 2.50 |
| 13 | 5 | 6 | 1.79 | 2.14 |
| 14 | 1 | 2 | 0.36 | 0.71 |
| 15 | 5 | 3 | 1.79 | 1.07 |
| 16 | 2 | 1 | 0.71 | 0.36 |
| 17 | 2 | 2 | 0.71 | 0.71 |
| 18 | 6 | 4 | 2.14 | 1.43 |
| 19 | 5 | 3 | 1.79 | 1.07 |
| 20 | 5 | 6 | 1.79 | 2.14 |
| 21 | 6 | 4 | 2.14 | 1.43 |
| 22 | 4 | 3 | 1.43 | 1.07 |
t=0.938，P>0.05
表1中数字为22例患者NS5 A区部分核苷酸序列(6 936-7 200)与HCV-J及HCV-HB株相比较核苷酸发生变异个数及变异率，与HCV-J比较平均变异率为5个核苷酸，与HCV-HB相比，平均变异率为4.4个核苷酸，变异率分别为1.78%和1.57%。表明患者与HCV-J及HCV-HB同源性相近。经配对计量资料比较的t检验法，统计学处理两者差异无显著性意义。但以上突变大多为同义突变。22例患者在干扰素治疗前HCV NS5 A区氨基酸序列情况与HCV-J及HCV-HB相比，22患者中3例仅有1个氨基酸变异，1例有3个氨基酸变异，即仅4例患者为中间型，18例野生型，无突变型。两名患者变异位点与国外文献报道一致，即2 219位由H变为R。
2.2 干扰素疗效与HCV NS5 A区氨基酸变异的关系 由表2可见，干扰素治疗后患者暂时反应尚可，有效率为61.1%，但复发率也高，为63.6%。故远期疗效较差。22例丙型肝炎患者中无突变型。18例经干扰素治疗，统计学(χ2 =0.0476，P>0.05)检验，野生型与中间型在无效、近期有效、复发方面差异无显著性。远期疗效尚待继续观察。
表2 22例患者的干扰素疗效与氨基酸变异关系
Tab.1 The relationship between interferon treatment effect
and amino acid variation in patients
| 型别 Type | 无效例数 Cases of no reaction | 暂时反应例数 Cases of transient reaction | 复发例数 Cases of relapse |
| 野生型 Wild type | 6 | 9 | 5/9 |
| 中间型 Intermediate type | 1 | 2 | 2/2 |
| 突变型 Mutant type | 0 | 0 | 0 |
表3 干扰素治疗后每个患者的核苷酸变异个数
Tab.3 The nucleotide variation number after interferon therapy
| 组别 Group | 例数 Cases no. | 每个患者核苷酸变异个数 Nucleotide variation number in patients |
| 干扰素治疗组 Interferon group | 8 | 1，5，2，2，3，3，3，1 |
| 对照组 Control group | 4 | 1，0，0，0 |
22例患者核苷酸序列与HCV-J及HCV-BK比较，变异少，且多为同义突变，不存在插入或缺失突变，表明HS5 A区高度保守。同时两者差异不显著，表明与HCV-J及HCV-HB株亲缘关系较近。分析氨基酸2 209-2 248序列，22例患者中18例为野生型，4例中间型，无突变型，突变型比率很低。与各国文献报道类似[6] 。18例经干扰素治疗者，治疗中暂时反应尚可，但复发率较高。疗程结束半年内仅4例血清HCV RNA为阴性，其中包括2例急性肝炎。且4例暂时有效者停药时间较短，继续观察也有复发的可能性，故单从抗病毒而言，HCV1b型临床治疗意义不大。日本学者提出干扰素敏感决定区的问题，Sakuma等[7] 认为，干扰素治疗有效后复发者是因为野生株经选择从非优势株转为优势株。但本文4例治疗有效的患者治疗前采用直接测序法，测定的优势株即为野生型，经干扰素治疗后病毒曾近期有效。而同样序列的病毒在另外的患者则治疗无效，故干扰素敏感决定区可能不是决定性因素，不适用于中国丙型肝炎患者。由于未发现突变型HCV患者，目前尚不能从另一面证实突变型对干扰素治疗是否有效，需要在下一步工作中完成。另外，经比较发现，干扰素治疗后核苷酸变异率有所增加，从而对病毒序列有选择作用，进一步研究可能找出氨基酸变异的规律。
参考文献
1 Wang Y, Okamoto H, Tsuda F, et al. Prevalence, genotypes, and an isolate(HC-C2) of hepatitis C virus in Chinese patients with liver disease. J Med Virol, 1993, 40:254-260.
2 Enomoto N, Sakuma I, Asahina Y, et al. Comparison of full-length sequences of interferon-sensitive and resistant hepatitis C 1b viruses. J Clin Invest, 1995, 96:224-230.
3 Enomoto E, Sakuma I, Asahina Y, et al. Mutations in the nonstructural protein 5A gene and response to interferon in patients with chronic hepatitis C 1b infection. N Eng1 J Med, 1996, 334:77-81.
4 Chayama K, Tsubota A, Kobayashi M, et al. Pretreatment virus load and multiple amino acid substitution in the interferon-sensitivity determining region predict outcome of interferon treatment in patients with chronic genotype 1b hepatitis C virus infection. Hepatology, 1997, 25:750-753.
5 Zeuzem S, Jung-lee, Roth W, et al. Mutation in the nonstructural 5A gene of European hepatitis C virus isolates and response to interferon alpha. Hepatology, 1997,25;740-744.
6 Chung RT, Monto A, Daienstag JL, et al. NS5 A mutations do not predict response to interferon in American patients infected with genotype 1b hepatitis C virus. Gastroenterology, 1997,112:A1245-1245.
7 Sakuma I, Enomoto N, Asahina Y, et al. Differential effect of interferon therapy on hepatitis C virus 1b quasispecies in the non-structural 5A gene. Hepatology, 1997, 112:A1371-1372.
(收稿：1998-08-03 修回：1998-12-14)
, 百拇医药