细胞图像分析预测食管上皮增生转归的研究

http://www.100md.com 《中华肿瘤杂志》 1999年第6期

周彬 丁镇伟 郭黎平 潘秦镜 高峰 王继信 林培中 100021 北京，中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤研究所肿瘤医院 中华肿瘤杂志 1999 0 21 6
关键词：食管肿瘤；癌前病变；高分辨率细胞图像分析；食管上皮增生；染色质特征；代用终期生物学指标 期刊 zhzlzz 0 临床研究 fur -->

【摘要】 目的 探讨食管癌前期病变细胞核的染色质特征与癌变的关系，并对其癌变进行早期预测。方法 标本取自1983年林县河顺乡食管细胞学普查。鳞状上皮重度增生93例，轻度增生122例。所有标本均为食管拉网涂片，巴氏染色。图像输入设备是Axiomat图像分析系统，由VAX4000-500计算机控制，idl软件。每一样本随机选择100以上保存完好的鳞状上皮中层细胞，用100×物镜进行细胞核的测量。结果 从100多个染色质形态、光密度和纹理的特征中，选出15个有意义的特征进行判断。93例重度增生3年、5年和9年后癌变的病例作为高分辨率细胞分析样本，细胞图像分析判断为癌变的分别为18例、12例和6例，判断正确率分别为75.0%(18/24)、85.7%(12/14)和85.7%(6/7)；122例轻度增生3年、5年和9年后癌变的病例，细胞图像分析判断为癌变的分别为15例、10例和10例，判断正确率分别为93.8%(15/16)、76.9%(10/13)和83.3%(10/12)。结论 利用高分辨率细胞图像分析系统提取细胞核的特征能够区别癌变组和非癌变组，并可对癌前病变进行癌变的早期预测，在肿瘤预防研究中可以作为代用终期生物学指标之一。

Prediction of theoutcome of dysplasia of esophageal epithelium by high resolution image analysis

ZHOU Bin, DING Zhenwei, GUO Liping, et al. Cancer Institute (Hospital),Chinese Academy of Medical Sciences, Peking Union Medical College, Beijing 100021

【Abstract】 Objective To predict the outcomeof dysplasia of esophageal epithelium by means of high resolution image analysis(HRIA).Methods Asymptomaticadults were examined for balloon cytology of the esophagus in 1983 from Heshun Commune ofLinxian County. Ninety three cases of severe dysplasia and 122 cases of mild dysplasia ofthe esophagus were selected for this study. By means of an Axiomat-microscope equippedwith TV-camera, 100 normal nuclei of well-preserved cells in the intermediate layer ofPap-stained squamous epithelium were randomly examined.Results Of the93 cytologically diagnosed severe dysplasia cases, 24, 14 and 7 progressed to carcinoma in3, 5 and 9 years, respectively. In the other 48 cases, dysplasia remained stable orregressed to normal. The other cases were used as the control. According to chromatinfeatures, correct diagnosis of cases was achieved by HRIA in 75.0%(18/24), 85.7%(12/14)and 85.7%(6/7) of the cases examined, respectively (P<0.001). Of the 122 cytologicallydiagnosed mild dysplasia, 16, 13 and 12 cases progressed to carcinoma in 3, 5 and 9 years,respectively. The other 81 cases remained stable or regressed to normal. Correct diagnosiswas made by HRIA in 93.8%(15/16), 76.9%(10/13) and 83.3%(10/12) of the cases examined,respectively (P<0.001).Conclusion Chromatin nuclear features examinedby HRIA can predict the outcome of precancerous lesions and discriminate progressor from non-progressor ones. It can be used as surrogate endpoint biomarkers for the evaluation ofefficiacy of chemoprevention trial.
【Subject words】 Esophageal neoplasms Precancerouslesions High resolution analysis Esophageal dysplasia Chromatin features Surrogateendpoint biomarkers

当今应用模式识别方法进行生物图像自动分析在肿瘤诊断、预后估计、预防等方面的研究中起到越来越重要的作用。食管癌是常见、预后差的恶性肿瘤之一。据1985年的统计，食管癌的发病率占恶性肿瘤的第9位，世界上约50%的食管癌发生在中国^[1] 。大量研究表明，食管鳞状上皮非典型增生是食管癌的前驱病变，具有在将来的某一时间变为癌的潜能。因此，对具有癌前病变的高危人群进行化学预防治疗是降低食管癌发病率和死亡率的重要步骤^[2] 。近年来，肿瘤的预防越来越受到重视，并且取得非常好的结果^[3] 。但是由于癌前病变发展到癌是一个长期慢性的过程，而现在一般是使用癌变抑制率作为肿瘤预防的终期指标。因此，为了通过统计学检验，必须有大规模的人群(数以千计的样本)、长期的时间(5～10年)和大量的人力物力(几百万资金)。这样，肿瘤预防领域所面临最大的问题是，迫切需要找到一个实用、敏感的肿瘤预防代用终期生物学指标(surrogateendpoints biomarkers, SEBs)^[4] 。我们应用细胞图像分析系统对细胞核染色质特征进行分析，希望能够作为一种有效和实用的SEBs。

材料与方法
1.标本： 取自1983年林县河顺乡40～65岁居民的食管细胞学检查。93例食管鳞状上皮重度增生(包括鳞状上皮重度增生Ⅰ级和Ⅱ级)，其中24例3年后、14例5年后和7例9年后分别癌变，另48例无癌变者作为对照组。122例食管鳞状上皮轻度增生，其中有16例3年后、13例5年后和12例9年后分别癌变，而另81例无癌变者作为对照组(表1)。所有标本均为食管拉网涂片，巴氏染色。

表1 细胞学诊断结果及测量标本和细胞数

注：( )内为细胞测量数

2.数据获取： 图像输入设备为Axiomat显微镜和Bosch电视摄像机，由VAX4000-500计算机(DM，USA)控制，idl软件。其空间分辨率0.25μm/步；光度分辨率8 bit，即可将收检样品各部分透光度线性地分为256灰阶度；单色光波长548nm。每一例标本随机选择100多个保存完好的鳞状上皮中层细胞，用100×物镜(油浸，数字孔径1.3)进行细胞测量。图像分析系统对每一个细胞核进行自动区域划分，如果自动区域划分不理想，便用鼠标进行人工标定细胞边界。对每一细胞核抽提100多个特征(包括形态、光密度和纹理特征)。特征的选择与分类判决使用分级线性和非线性判决方法。根据误识率最小的标准对一系列F值及入选特征进行评价，从中选出最有意义的几个特征作为判决指标(表2)。

表2 食管上皮重度增生细胞图像分析预后判断正确率

3.统计学处理： 所有统计学处理在SAS和MBDP软件包中完成。使用两级逐步线性判别分析方法对细胞进行分析。特征的判定是选择有单变量意义的特征而并不依赖于标本染色和制备方法的变化。根据F统计值逐步选择10多个特征，首先选择的是单变量意义的特征值，之后特征选择的F值为多变量，并共同对结果进行判定。使用后验概率(aposteriori probability， APOP)平均值的分布对每一病例进行判别；而对每一组病例的分类判别使用后验概率平均值和双重标准误差平均值(thedouble standard error of the mean， S.E.M.)。所有病例的后验概率平均阈值(THR)限定在APOP＝0.5，如果病例阈值的计算结果是THRε{APOP±2S.E.M.}既称为不确定病例。所有统计学处理在95%水平。

结果
93例食管上皮重度增生病例的细胞图像分析结果见表2。24例3年后发展为癌的病例，有18例细胞图像分析预后判断为癌变，判断正确率为75.0%(P>0.001)；19例3年后未癌变的对照组中，有13例预后判断为不癌变，判断正确率为68.4%(图1，表2)；最有意义的特征是暗点数目(numberof dark particles， DNO)，其他特征有暗点相对区域(relative area of darkparticles，DAA)、高位结构不对称性(skewness of upper skeleton,HUM3)。14例5年后癌变的病例，细胞图像分析有12例预后判断为癌变，判断正确率为85.7%(P<0.0001)；10例5年后未癌变的病例，有8例预后判断不癌变，判断正确率为80.0%(图2，表2)；最有意义的特征是平面矩阵结构熵总和(sumentropy of flat texture co-occurrence matrix,NC9)，其他是染色质不均匀性(heterogencityof chromatin,HETERO)和局部多分维数排列(range of local multifractal dimension,MFRANG)。7例9年后癌变的病例中，有6例预后判断为癌变，判断正确率为85.7%(P<0.001)；19例9年后未癌变的病例中，15例预后判断不癌变，判断正确率为78.9%(图3，表2)；最有意义的特征为平面结构相关测量值(measureof correlation of co-occurrence of flat texture,NC13)，其他有平面结构长矩分布(longruns emphasis of runlength distribution of flat texture,RL2)、消光测量值(measure ofcorrelation of co-occurrence of extinction,CO12)。总的来看，45例9年内癌变的病例，经细胞图像分析，预后判断为癌变的有36例，判断正确率80.0%(表2)。

图1 食管上皮重度增生3年内癌变组细胞图像分析

图2 食管上皮重度增生5年内癌变组细胞图像分析

图3 食管上皮重度增生9年内癌变组细胞图像分析

122例食管上皮轻度增生病例的细胞图像分析结果见表3。16例3年后、13例5年后及12例9年后癌变的病例，细胞图像分析判断为癌变的分别有15例、10例和10例，判断正确率分别为93.8%(P<0.0001)、76.9%和83.3%(P<0.001)。3年、5年和9年后未癌变各27例作为对照组，预后判断不癌变的分别为24例、19例和21例，判断正确率分别为88.9%、70.4%和77.8%(图4～6)。3年癌变组最有意义的特征为平面结构短矩分布(shortruns emphasis of runlength distribution of flat texture,NR1)、消光平均值总和 (sumaverage of co-occurrence of extinction,CO6)、高位结构排列(range of upper skeleton,HUSPAN)；5年癌变组最有意义的特征是平面结构相关系数(correlationof co- occurrence of flat texture,NC3)、NR1，CO6仍然为重要特征之一；9年癌变组最有意义的特征是MFRANG、局部多分维数不对称性(skewnessof local multifractal dimension,MFM3)、消光局部平均值(local mean of co-occurrenceof extinction,CO14)。轻度增生组总共有41例在9年内癌变的病例,细胞图像分析预后判断癌变的有35例，判断正确率为85.4%(表3)。

表3 食管上皮轻度增生细胞图像分析预后判断正确率

图4 食管上皮轻度增生3年内癌变组细胞图像分析

图5 食管上皮轻度增生5年内癌变组细胞图像分析

图6 食管上皮轻度增生9年内癌变组细胞图像分析

讨论
1966年Mendelsohn等^[5] 使用高分辨率细胞数字图像分析系统对白细胞进行5种类型的分类，这一经典结论使生物图像分析和分类进入了新的时期。1980年和1981年Burger等^[6] 和Wied等^[7] 用细胞图像分析方法对宫颈癌标本中正常形态的上皮细胞测量中发现有异常表现。1997年高峰等^[8] 用高分辨率细胞图像分析系统对食管鳞状上皮重度增生的细胞进行测量后发现，5年后癌变的高危重增组和不发生癌变的低危重增组的正确分组率达80%以上。
我们的研究结果表明，利用高分辨率细胞图像分析系统提取食管上皮增生标本中保存完好的鳞状上皮中层细胞核的特征，能够区别癌变组和非癌变组。鳞状上皮重度增生是食管的癌前病变，经细胞图像分析预后判断癌变的正确率在80%以上。而鳞状上皮轻度增生被认为不是食管的癌前病变，其性质与正常的食管上皮差异无显著性^[2] ，发展为癌的可能性较小，但经细胞图像分析预后判断癌变的正确率亦在85%以上。表明对于判断食管鳞状上皮增生的转归和癌变以及食管鳞状上皮增生的分级，细胞图像分析明显优于细胞形态学的诊断。对没有发生癌变的重度和轻度增生的病例，细胞图像分析预后判断不癌变的正确率在80%左右。这一结果表明，这些病例可能不是真正的癌前病变，而只是反应性的细胞改变，只是用常规的形态学检查方法不能够区别。因为形态学的改变，例如核增大、染色质增多、核形不规则等是DNA改变的外在表现，而不能了解DNA形态学改变的深层意义。因此，对于真正癌前期病变的确定，细胞图像分析明显优于细胞形态学的诊断，这在区别那些形态相似而生物学行为不同的病例时尤为突出。至于为什么增生与癌变的时间有长短之差，增生和癌变的时间与细胞图像分析的哪些特征有关，尚待进一步观察及深入的研究。我们选择细胞测定方法是随机测定保存完好的“正常”鳞状上皮中层细胞，而不是选择有细胞形态变化的“增生”细胞。众所周知，虽然现今的诊断标准对大多数病例是适用的，但是任何形态学方法都有其固有的缺点，即特异性低，常有一定的主观因素。对有形态变化细胞的诊断，不同人做出的诊断很可能有相当比例是不同的，这在诊断交界性病变时更突出。我们用形态表现为正常的鳞状上皮中层细胞作为图像分析测定样本，可避免和减少主观因素造成的误差，提高结果的真实性。以上结果表明，利用图像识别方法提取细胞核的特征能够对癌前病变进行癌变的早期预测，并且在肿瘤预防领域里可以作为代用终期生物指标之一。
本研究在德国慕尼黑国立环境与健康研究中心病理研究所完成

本课题受国家“八五”科技攻关资助(编号85-914-01-02)

参考文献
1 Parkin DM, Pisani P, Ferlay J. Estimates of the worldwide incidence ofeighteen major cancer in 1985. Int J Cancer, 1993,54:594-606.
2 林培中，张金生，曹世国，等.食管癌的二级预防——食管癌前病变的阻断性治疗.中华肿瘤杂志，1988，10：161-166.
3 林培中，张金生，戎振鹏，等.食管癌前病变的阻断性治疗——抗癌乙片、维胺酯和核黄素3年和5年的阻断效果.中国医学科学院学报，1990，12：235-245.
4 Boone CH, Kelloff G. Development of surrogate endpoint biomarkers for clinicaltrials of cancer chemopreventive agents: relationships to fundamental properties ofpreinvasive (intraepithelial) neoplasia. J Cell Biochem 1994,19suppl:10-22.
5 Mendelsohn ML, Mayall BH, Prewitt JMS, et al. Digital transformation and computeranalysis of microscopic image In: Barer R ed. Advance in Optical and Electron Microscopy.1st ed. New York: Academic Press, 1968.21.
6 Burger G, Jutting U, Rodenacker K. Changes in benign cell populations in cases ofcervical cancer and its precursors. Analyt Quant Cytol, 1981,3:261-271.
7 Wied GL, Bartels PH, Bibbo M, et al. Cytomorphometric markers for uterine cancer inintermediate cells. Analyt Quant Cytol, 1980,2:257-263.
8 Gao F, Jutting U, Rodenacker K, et al. Relevance of chromatin features in theprogression of esophageal epithelial severe dysplasia. Analyt Cell Pathol, 1997,13:17-28.

(收稿：1998-08-24 修回：1998-11-16) , 百拇医药

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