慢性乙型肝炎病人血清及外周血单个核细胞培养上清液白细胞介素-10的检测及其临床意义

http://www.100md.com 《中华肝脏病杂志》 1999年第4期

季伟 王慧芬 冯传前 鞠连才 赵敏 貌盼勇 100039 副主任医师，博士。 中华肝脏病杂志 1999 0 7 4
关键词：乙型肝炎 外周血单个核细胞 白细胞介素-10 期刊 zhgzbzz 0 临床研究 fur -->

【摘要 】 目的 探讨慢性乙型肝炎(CHB)病人血清及外周血单个核细胞(PBMC)培养上清液白细胞介素-10(IL-10)检测的临床意义。方法 分离15例CHB病人及6名正常人血清及PBMC。PBMC体外单独或与金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)或重组HBcAg(rHBcAg)共培养48小时后，用双抗体夹心ELISA方法检测血清及PBMC培养上清液IL-10水平。结果 CHB病人血清IL-10水平为(123.11±13.89)ng/L，正常对照组平均为(95.97±11.68)ng/L，两者之间差异有非常显著性，P<0.01。PBMC体外培养48小时，培养上清液中IL-10水平均明显高于正常对照组，P<0.01。其中rHBcAg诱导病人PBMC产生的IL-10水平最高，达(369.58±30.52)ng/L。HBVDNA阳性病人血清及PBMC培养上清液IL-10水平均明显高于HBV DNA阴性组病人。慢性轻度和中度肝炎病人血清及PBMC培养上清液IL-10水平又高于慢性重度或慢性重型肝炎病人。结论 CHB病人血清及PBMC培养上清液IL-10水平升高可能与HBV持续感染有关。

Interleukin10(IL-10) levels in serums and in culture supernatants of peripheral blood mononuclearcells from patients with chronic hepatitis B

JI Wei, WANG Huifen, FENG Chuanqian, et al.
302 Hospital of PLA, Beijing 100039

【Abstract 】 Objective To understand the impacts of interleukin10(IL-10) in serums and in culture supernatants of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from patients with chronic hepatitis B (CHB) on the persistent infection ofhepatitis B virus (HBV). Methods The levels of IL-10 in serums and inculture supernatants of PBMCs from 15 patients with CHB and 6 normal controls weremeasured by ELISA method. PBMCs were cultured with or without Staphylococcus aureusenterotoxin B(SEB; 0.2mg/ml) or recombinant HBcAg(rHBcAg; 1.0mg/ml) for 48 hours in vitro.Results The levels of IL-10 in serums was greater in patients with CHB(123.11±13.89ng/L) than in controls (95.97±11.68ng/L, P<0.01). Spontaneous, SEB-induced and rHBcAg-induced IL-10 production by PBMCs after culturing in vitro for 48hours was also higher in patients with CHB (280.82±50.56ng/L, 321.69±37.04ng/L and369.58±30.52ng/L) than in controls (100.2±8.54ng/L, 203.41±12.02ng/L and 202.38±15.79ng/L;P<0.01). In addition, IL-10 production by rHBcAg-stimulated PBMCs was significantlygreater than by SEB-stimulated PBMCs in patients with CHB. Patients with seropositive forHBV DNA had higher levels of IL-10 in serums and in culture supernatants of PBMCs thanpatients with seronegative for HBV DNA. But the levels of IL-10 were lower in patientswith chronic heavy and severe hepatitis B than in patients with chronic mild and moderatehepatitis B. Conclusion IL-10 may have an important role in persistentinfection of HBV in patient with CHB.
【Key words 】 Hepatitis B Peripheral blood mononuclear cells Interleukin-10

旨在通过检测慢性乙型肝炎(CHB)病人血清白细胞介素-10(IL-10)和观察病人外周血单个核细胞(peripheralblood mononuclear cell, PBMC)培养上清液IL-10水平，探讨IL-10在乙型肝炎病毒(HBV)持续感染中的作用。

资料与方法

1. 研究对象：15例住院男性CHB病人均符合1995年《病毒性肝炎防治方案(试行)》的诊断标准^[1] 。年龄16～45岁，平均32.9岁。慢性肝炎轻度6例，中度2例，重度2例，慢性重型肝炎5例。其中5例经病理证实为慢性肝炎轻度或中度。血清HBVDNA阳性病人10例；血清HBeAg阳性9例。6名健康人为正常对照。
2.分离外周血单个核细胞：抽取肝素抗凝全血10ml，先离心收取血清，冻存于-20℃备检，然后用淋巴细胞分离液(中国医学科学院血液病研究所产品)分离PBMC^[2] ，经2%台盼蓝染色证实活细胞在95%以上。
3. 细胞培养：将PBMC分成空白组、重组HBcAg(r-HBcAg, 1.0mg/ml，由戎广亚博士和程云博士馈赠)处理组和金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB0.2mg/ml，美国Sigma公司产品)处理组。细胞培养于24孔板内，在37℃、CO₂ 体积分数为0.05的条件下培养。培养液为含10%灭活胎牛血清(美国Gibco公司产品)、2mmol/L谷氨酰胺(美国Sigma公司产品)和青、链霉素各100U/ml的RPMI1640(美国Gibco公司产品)。每孔细胞约1×10⁶ 。细胞培养48小时后收取培养上清液并冻存于-20℃。
4. IL-10检测：从-20℃中取出标本，室温下融化后用双抗体夹心ELISA法(试剂盒为美国Genzyme公司产品)按试剂盒说明书检测血清及PBMC培养上清液IL-10水平。
5. 统计分析：各组资料用t或t′检验。

结果

1. CHB病人血清及PBMC培养上清液IL-10水平：CHB病人血清IL-10水平为(123.11±13.89)ng/L，正常人血清IL-10水平为(95.97±11.68)ng/L，两组之间差异有非常显著性，P<0.01。体外单独培养，以及用SEB或rHBcAg刺激48小时后，病例组PBMC培养上清液IL-10水平均明显高于正常对照组，各配对组之间差异有非常显著性，P<0.01(表1)。

表1 血清及PBMC培养上清液IL-10水平(ng/L，±s)

^* 与对照组比较，P<0.01

2.SEB与rHBcAg诱导CHB病人PBMC产生IL-10作用：正常人PBMC体外无论用SEB还是用rHBcAg刺激培养48小时，培养上清液IL-10水平在两组间差异无显著性，P>0.05。但是体外用SEB和rHBcAg分别刺激CHB病人PBMC48小时后，SEB刺激的PBMC培养上清液IL-10水平显著低于rHBcAg刺激后的水平，两者之间的差异有非常显著性，P<0.01(表2)，提示rHBcAg刺激CHB病人PBMC产生IL-10的作用更强。

表2 SEB与rHBcAg诱导CHB病人PBMC产生的IL-10(ng/L，±s)

^* 与对照组比较，P<0.01

3. HBV复制与IL-10产生的关系：为进一步观察CHB病人血清或PBMC培养上清液IL-10水平与HBV复制的关系，将病人分为血清HBVDNA阳性和阴性组，分别观察两组病人血清或PBMC培养上清液IL-10水平。HBVDNA(+)组病人血清IL-10水平为(129.92±9.25)ng/L，HBV DNA(-)组病人为(109.48±11.58)ng/L，两组之间差异有显著性，P<0.05。体外单独培养，以及用SEB或rHBcAg刺激48小时后，HBVDNA(+)组PBMC培养上清液IL-10水平明显高于HBV DNA(-)组，各配对组之间差异有非常显著性，P<0.01(表3)。

表3 血清HBV DNA阳性与阴性组病人血清及PBMC培养上清液IL-10水平(ng/L，±s)

与HBV DNA(-)组比较#P<0.05，*P<0.01

4. 肝损伤程度与IL-10产生的关系：将CHB病人分为肝损伤轻型组和重型组。轻型组包括慢性轻度肝炎和慢性中度肝炎病人，重型组包括慢性重度和慢性重型肝炎病人。轻型组和重型组肝炎病人不仅血清IL-10水平均明显高于正常对照组，而且无论单独培养还是用SEB或rHBcAg刺激培养48小时后，轻型组和重型组肝炎病人PBMC培养上清液IL-10水平均明显高于正常对照组，与正常对照组相比差异均有非常显著性，P<0.01。此外，轻型组与重型组之间差异也有显著性或非常显著性，P<0.05或P<0.01(表4)。

表4 肝损伤程度对CHB病人血清及PBMC培养上清液IL-10水平(ng/L，x±s)

*与对照组相比，P<0.01；△与对照组相比，P<0.05；#与重型组相比，P<0.01；☆与重型组相比，P<0.05

讨论

IL-10是一种Th₂ 型细胞因子，可抑制Ⅱ型主要组织相容性复合物(MHC-Ⅱ)和B₇ 分子表达，抑制Th₁ 型细胞因子表达或拮抗Th₁ 型细胞因子活性，并具有抗炎作用^[3] 。本研究结果显示，不仅CHB病人血清IL-10水平明显高于正常对照者，而且CHB病人PBMC在体外培养48小时后，无论自发性还是由SEB或rHBcAg刺激后的培养上清液IL-10水平均明显高于正常对照组。其中由rHBcAg诱导PBMC产生的IL-10水平最高。表明CHB病人体内Th₂ 型细胞免疫反应增强，这可能是HBV在体内持续感染的结果。进一步分析发现，HBVDNA阳性病人血清及PBMC培养上清液IL-10水平明显高于HBV DNA阴性组病人；慢性重度或慢性重型肝炎病人血清及PBMC培养上清液IL-10水平却低于慢性轻度或慢性中度肝炎病人，表明IL-10水平升高不仅可抑制宿主抗HBV细胞免疫活性，导致HBV体内持续复制和表达，而又可抑制HBV感染引起的肝脏炎症反应，减轻肝脏损伤，致使肝脏病变迁延不愈。

季伟 男，39岁，副主任医师，博士。

参考文献

1病毒性肝炎防治方案(试行). 中华内科杂志，1995，34：788-791.
2杨景山. 血液及其它悬液细胞采集、分离和标本制作.见：杨景山，主编. 医学细胞化学与细胞生物技术. 第1版.北京：北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社出版，1990. 1-17.
3Moore KW, O'Grarra A, De-Waal-Malefyt R, et al. Interleukin 10. Annu Rev Immunol, 1994,11: 165-190.

(本文编辑：金生 校对：袁平戈)
(收稿：1998-10-28 修回：1999-07-09) , 百拇医药

    百拇医药网 http://www.100md.com/html/DirDu/2005/07/06/65/14/00.htm