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关键词：鼻咽肿瘤；癌前状态；爱泼斯坦-巴尔病毒；基因，病毒；聚合酶链反应
【摘要 】 目的 探讨非癌鼻咽上皮细胞发展为鼻咽癌 (NPC)的过程中， EB病毒在什么阶段进入鼻咽上皮。方法 利用广州中山医科大学肿瘤防治中心四会县防癌基地 1994年度复查工作及肿瘤医院门诊，收集鼻咽癌及各类“癌前状态”及“癌前病变”患者蜡块 450余例，应用改进后的多聚酶链反应 (PCR)方法进行 EBV-DNA酶基因片段扩增检测。结果 NPC 浸润癌组织 EBV-DNA酶基因片段扩增阳性率为 97.3%(145/149)， NPC原位癌 4例中，基因阳性者 2例，而防癌基地“癌前状态”人群 155例中阳性者 2例，阳性率为 1.3%(2/155)。临床癌前病变组阳性率为零 (0/47)。结论 EB 病毒在非癌鼻咽组织中出现频率十分低， EB病毒可能在鼻咽上皮癌变后才进入鼻咽上皮，提示 EB 病毒可能不是 NPC 的病因。
The examination of EBV-DNase genefragment in the paraffin embedded NPC, pre-cancerous and high risk populationnasopharyngeal tissues Huang Bijun, Huang Di, Wu Qiuliang. Cancer Institute,Sun Yet-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510060
【 Abstract 】 Objective To examine if EB virus entersnasopharyngeal epithelial cells in the course of the tumorigenesis in nasopharyngealcarcinoma (NPC). Methods Based on the annual investigation of Si-Hui county, acancer-prevention base of the Sun Yet-sen University of Medical Sciences and TumourHospital out-patient clinic, more than 450 paraffin-embedded tissues with NPC, and withpre-cancerous lesions in high risk populations were collected for the detection ofEBV-DNase gene fragment by an optimized PCR method. Results In 145 of the 149(97.3%) caseswith invasive NPC, and 2 of 4 cases with in situ NPC, EBV-DNase gene was detected.However, in Sihui, Canton, a high-risk county for NPC, only 2 of the 155 subjects withnasopharyngeal precancerous state was the gene positive, and none of the 47 cases examinedin the out-patient department of the Tumor Hospital with precancerous lesions in thenasopharynx was positive. Conclusion EBV is seldomly detected in the non-malignant andprecancerous lesions in the nasopharynx in high-risk populations. It implies that EBV isprobably not etiologically involved in the genesis of NPC.
【 Subject words】 Nasopharyngeal neoplasms Precancerous conditions Epstein-Barr virusGenes, viral Polymerase chain reaction
鼻咽癌 (NPC)有一个相当长的癌前阶段，包括癌前状态和癌前病变[ 1～ 3] 。为了探讨 Epstein-Barr病毒 (EBV)究竟在什么“癌前状态”进入鼻咽上皮，我们于 1994年在中山医科大学肿瘤防治中心防癌基地“八五”攻关研究课题年度复查时，收集处于各种 NPC “癌前状态”活检组织 155例，用新合成的引物及改进的方法[ 4] 进行 EBV-DNA酶基因多聚酶链反应 (PCR)扩增检测，并测序以确定特异性。
材料与方法
一、细胞和组织
EBV 阳性细胞株 B95-8、 EBV阴性细胞株 K562均取自广州中山医科大学肿瘤研究所保存细胞株。 NPC石蜡包埋组织标本及 NPC 、“高危人群”[ 4] 鼻咽组织石蜡包埋标本均取自中山医科大学肿瘤医院病理科。
二、 PCR及产物 DNA序列分析
1.引物：我们根据 gene bank基因库 VO1 555， BG LF5读码框， EBV-DNA酶基因序列设计，产物为 408bp，为全基因的 29%。由海南医学院蛋白质及核酸研究室合成，其序列为：引物Ⅰ 5′ >CTGATGTGG- GACATATTGCG<3′；引物Ⅱ 5′ >CCTCTTGTAAAG- CGCAGTGT<3′。
2.PCR扩增 EBV-DNase 基因：石蜡包埋组织切片经二甲苯脱蜡，乙醇洗涤、脱水。加裂解缓冲液 100 μ l(蛋白酶 K浓度为 100 μ g/ml)置于 56℃水浴轻摇过夜，并于 98℃ 10分钟灭活蛋白酶 K，离心上清作为 PCR 扩增模板。扩增条件为 94℃ 5分钟变性， 94℃ 45秒、 55℃ 45秒、 72℃ 1分钟， 30个循环， 72℃延伸 7分钟。凝胶电泳紫外分析扩增产物。
3.DNA序列分析：用 Biorad 公司 PCR 扩增 DNA片段纯化试剂盒纯化 PCR 产物。序列分析采用 EBV-DNA酶基因负链 (引物Ⅰ)，试剂为 PE公司 DNA测序试剂盒；仪器为 PE公司 377型 DNA序列分析仪。
结果
1.EBV-DNA酶基因检测： B95-8及 NPC 组织扩增产物为 408 bp，而 K 562细胞株及高危人群鼻咽组织则不能扩增出此片段 (附图 )。 PCR 扩增产物的 DNA序列分析结果显示，基因碱基编码序列与 gene bank VO1555中 BGLF5读码框的相关序列完全相符。
1：分子量对照； 2： B95-8细胞株； 3： K562细胞株；
4， 5， 7， 8， 10， 11： NPC组织； 6， 9：高危人群鼻咽组织
附图 EBV-DNA酶基因 PCR 结果
2.鼻咽癌及高危人群鼻咽组织 EBV-DNA酶基因 PCR 检测：经病理确诊的鼻咽癌患者及高危人群鼻咽组织 EBV-DNA酶基因 PCR 检测结果见表 1。
3.癌前病变各阶段病例中 EBV-DNA酶基因检
表 1 鼻咽癌及高危人群鼻咽组织 EBV-DNA酶基因扩增结果
| 组 别 | 例数 | 基因阳性 (例 ) | 百分率 (%) |
| 鼻咽癌 | 4 | 2 | |
| 鼻咽浸润癌 | 149 | 145 | 97.3 |
| 高危人群鼻咽组织 | 155 | 2 | 1.3 |
测：我们收集了临床癌前病变鼻咽组织 47例，其中轻、中、重不典型增生分别为 24例、 14例和 9例，无一例发现有 EBV-DNA酶基因。同时，收集防癌基地癌前病变鼻咽组织 34例，其中轻、中、重不典型增生分别为 27例、 6例和 1例，仅在 27例不典型增生中发现 2例有 EBV-DNA酶基因。临床与现场癌前病变鼻咽组织中， EBV-DNA酶基因阳性率为 2.5%(2/81)，且 3种不同阶段癌前组织中的 EBV-DNA酶基因阳性率差异无显著性 (P>0.05)。
4.EBV-DNA酶基因与 NPC 抗体之间的关系：我们将具有下列血清学情况者列为癌前状态[ 3] ： (1)EB病毒 VCA/IgA>1∶80者； (2)EB病毒 DNA酶抗体 (EDAb)>60%者； (3)EB病毒 VCA/IgA>1∶5， EA/IgA>1∶5, EDAb≥30% 3项中任何 2项或 3项阳性者； (4)VCA/IgA、 EA/IgA及 EDAb 3项中任何一项持续上升者。癌前状态或癌前病变者被视为鼻咽癌高风险人群。防癌基地不同血清学阳性“癌前病变”组 EBV-DNA酶基因检出情况见表 2。
表 2 防癌基地各种“癌前病变”人群鼻咽组织 EBV-DNA酶基因扩增结果
| VCA >1∶ 80 | EDAb ≥ 30% | VCA>1∶ 80 EDAb ≥ 30% | VCA>1∶ 80 EA >1∶ 5 | EDAb≥ 30% EA >1∶ 5 | |
| 例数 | 89 | 60 | 61 | 10 | 9 |
| 基因阳性例数 | 0 | 1 | 1 | 0 | 0 |
| 基因阳性百分率 (%) | 0.00 | 1.7 | 1.6 | 0.00 | 0.00 |
讨论
研究结果表明， EBV与 NPC密切相关，但其病因学至今仍未得到确定。我们旨在确定，在不同时期的鼻咽上皮 EBV出现频率，从而进一步探讨 EBV可能出现的阶段。本研究实验结果显示， EBV-DNA酶基因在鼻咽癌组织中出现频率很高，而在“高危人群”的非癌鼻咽上皮中却非常低。这些实验结果提示了在鼻咽上皮细胞癌变过程中， EBV-DNA酶基因出现在细胞中的现象非常罕见。
本组 155例“高危人群”，是在约 40 000名自然人群中，主要根据血清学结果筛选出来的，其中 20 000多人已追踪了 6年 (1987年开始 )。从“癌前病变”及“癌前状态”人群扩增结果分析，基本上无明显差别，进一步说明非癌鼻咽上皮细胞在癌变过程中出现 EBV-DNA酶基因是非常罕见的事实。至于 4例鼻咽原位癌 EBV-DNA酶基因阳性者 2例，可能与活检组织体积小、组织中癌细胞少有关。特别是标本经过光镜检查切去几片后，很可能便将有癌细胞的部分切掉。 Yeung等[ 5] 也报道了类似的结果，在 6例鼻咽原位癌 EBV基因片段阳性者只有 3例。
近年来， Sam等[ 6] 报道高危人群鼻咽上皮细胞中 EBV基因片段的出现，由于他们标本例数不多，并局限于有明显症状的 NPC可疑患者，由此所获结果，总体上难免有存疑的地方。本组所用主要标本均来自我校防癌基地的自然人群，例数高达 155例， PCR的灵敏度高，尤其是本研究扩增产物特异性经过序列分析证明；加上本组按蜡块保存期研究结果选取标本，排除了蜡块标本失效的可能性。因而，研究方法可靠、灵敏度高及特异性强，对 EBV在鼻咽上皮细胞发展为 NPC哪一“阶段”或哪种“状态”中出现的问题，提供了明确可靠的资料。对 NPC的病因发病学、鉴别诊断学及其他可能与 EBV有关的慢性及恶性疾病的研究均有参考价值。
本课题受国家八五攻关基金资助
参考文献
1蔡海英，李博山，陈倪勇，等 . 鼻腔鼻咽的癌前期模型与维甲酰胺阻断癌变的实验研究 . 癌症， 1985， 4： 199-202.
2Feng BC, Liu KL. A morphological study of stromal microvasculature of nasopharyngealprecancerous lesions. Chinese Med J, 1991, 104: 422-425.
3黄腾波，汪慧民，李景廉，等 . 鼻咽癌高危人群癌前病变的确立 . 癌症， 1997， 12： 81-83.
4朱振宇，黄迪，马涧泉 . EB病毒特异性基因片段扩增在鼻咽癌诊断及鉴别诊断中的初步应用 . 中华肿瘤杂志， 1995， 17(增刊 )： 27-29.
5Yeung WM, Zong YS, Chiu CT, et al. Epstein-Barr virus carriage by nasopharyngealcarcinoma in situ. Int J Cancer, 1993,53: 746-749.
6Sam CK, Beook LA, Niedobiter G, et al. Analysis of Epstein-Barr virus infection innasopharyngeal biopsy from a group at high risk of nasopharyngeal carcinoma. Int Cancer,1993, 53: 957-959.
(收稿： 1997-11-20 修回： 1998-03-06) , 百拇医药