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编号:10652445
磷烧伤后出血机理及钙剂治疗效果的实验研究
http://www.100md.com 《中华整形烧伤外科杂志》 1998年第2期
李达 阮仕荣 胡安军 阎锋 朱森树 李春光 075000 张家口,解放军第二五一医院全军烧伤中心 中华整形烧伤外科杂志 1998 0 14 2
关键词:磷;烧伤;血小板;游离钙 期刊 zhzxsswkzz 0 论著 fur -->

【摘要】目的 探讨磷烧伤中毒的出血机理。
方法 采用45%磷酸烫伤及20mg/cm2 磷粉烧伤模型,两种模型致伤后创面残留总磷量及动物7天死亡率相同。
结果 磷酸与黄磷致伤后血浆游离钙显著低于正常及烧烫伤对照组(P<0.01),两组血小板游离钙显著降低,与正常组及烫伤烧伤组比较差异均有非常显著意义(P<0.01)。同时,磷酸组与黄磷组血小板聚集率与正常组及烧伤烫伤组比较也显著降低(P<0.01),黄磷及磷酸的钙剂治疗组血小板内外游离钙恢复至正常水平,血小板聚集也接近正常。
结论 磷烧伤后主要是磷酸与细胞内外的游离钙结合,通过降低血小板内游离钙水平,抑制血小板聚集,导致出血倾向。钙治疗可恢复细胞内外游离钙水平及血小板聚集功能而达到临床迅速止血的目的。
The mechanism of hemorrhage following phosphorus burns and the
effect of calcium gluconate
Li Da, Ruan Shirong, Hu Anjun, et al. Burn Center
of the 251st Hospital of People's Liberation Army, Zhangjiakou 075000

【Abstract】Objective
To investigate the mechanism of hemorrhagic tendency after phosphorus poisoning.Methods 45% phosphoric acid and 20mg/cm2 phosphorus were used to produce burn injury in rabbits. The totalcontent of phosphorus remaining on the wound and 7-day mortality were similar in both groups.Results The results showed that plasma free calciumcontents were significantly lower in both phosphorus groups than healthy and thermal burn controls (0.80 vs 1.40 mol/l, P〈0.01). The free calcium content of platelet was lowered to 116~140 nmol/l, which was significantly lower than that of healthy control (285 nmol/l) and thermal injury group (480~504 nmol/l).Concomitantly, the platelet aggregation rate was lowered to 1.29% and 10.78%in phosphoric acid group and phosphorus group, respectively, while it was 67.01% in healthy control and 82.1%~84.9% in thermal injury group; the difference was statistically significant.Conclusion Calcium therapy brought back
intracellular and extracellular free calcium contents to normal in phosphorus burn
group. Also platelet aggregation rate approached normal level after calcium therapy. The results suggest that the bleeding tendency after phosphorus burn is due to combination of phosphorus with intracellular and extracellular calcium of platelets, thus inhibiting aggregation of platelets.
【Key words】 Phosphorus Burn Platelet aggregation Free calcium

研究表明大面积磷烧伤患者常伴有出血倾向,且磷中毒越严重,出血越明显[1,2] ,表现为烧伤创面有出血点、出血斑及血尿和心、肺、肝、脑等脏器广泛性间质出血。为此,我们对比观察了磷酸及磷烧伤后血小板内游离钙、血浆游离钙变化及钙治疗后对其的影响,试图系统了解黄磷及磷酸烧伤后血小板游离钙的变化规律并探讨钙剂防治磷烧伤中毒的机理。
1 材料及方法
1.1 实验动物
新西兰大白兔95只,雌雄各半,体重2~2.5kg(购自军事医学科学院实验动物中心)。
1.2 仪器和试剂
试剂:Fura-2/AM、ADP、牛血清白蛋白(Bovine serum albumin)、4-2(羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(4-2-hydroxy ethyl-1-piperazineeth an esulfonic acid HEPES)、前列环素2 (PGI2 )均购自Sigma公司。黄磷及95%磷酸为张家口化工原料厂出品。
仪器:LS30-荧光分光光度仪(美国),Radiometer ICA1型游离钙分析仪(丹麦),SPA-3型全自动聚集仪,Philips CM-10型透射电镜。
1.3 烧伤模型及分组
1.3.1 实验动物分组
95只大白兔随机分为正常组(16只),黄磷烧伤组(黄磷组14只),磷酸烫伤组(磷酸组17只),烧伤组(12只),烫伤组(12只),黄磷烧伤治疗组(磷治组12只),磷酸烫伤治疗组(酸治组12只)。
1.3.2 烧伤模型制作[3]
实验动物背部按30%TBSA范围的皮肤剪毛,8%硫化钠脱毛后,以30mg/kg硫贲妥钠静脉注射麻醉,黄磷烧伤及治疗组采用磷粉(20mg/cm2 )完全燃烧致伤;烧伤组涂凝固汽油燃烧30秒致伤;磷酸烫伤及治疗组于加温至80℃的45%磷酸中烫伤30秒(体外实验表明,此浓度磷酸烫伤后皮肤残留总磷量与20mg/cm2 磷粉燃烧后皮肤残留总磷量均为6.1mg/cm2 );烫伤组于80℃热水中30秒致伤。黄磷及磷酸治疗组均于伤后开始分次静脉注射10%葡萄糖酸钙,首日10ml,第2,3天减半,第4天停用。各组均于伤后腹腔注射平衡盐溶液50ml/kg体重抗休克,并在伤后8,24,48,72,120,168小时心脏穿刺采血测定上述指标,并留取病理标本。
1.4 检测指标与方法
1.4.1 血小板细胞内钙测定[4]
用ACD抗凝剂(每升含:柠檬酸7mmol,柠檬酸三钠93mmol,葡萄糖140mmol,pH6.87)1∶6抗凝血5ml,室温下1000r/min离心10分钟,取出富血小板血浆(plateletrich plasma PRP),用适量37℃的Tyrode缓冲液洗涤、计数并调整血小板数为1~2×108 /L,取1ml加入PGI2 ,终浓度为10nmol/L及Fura-2/AM,终浓度2μmol/L,置37℃、5%CO2 温孵箱内振荡孵育30分钟后,室温下3000r/min离心10分钟,沉淀以Tyrode缓冲液洗涤一次,重悬至3ml加入EGTA,终浓度为5nmol/L,37℃水温箱保温10分钟,荧光分光光度计激发波长340nm、发射波长500nm测定荧光强度(F)值,依次加入TritonX-100(0.1%),MnCl2 (10nmol/L)分别测得Fmax、Fmin并按下列公式计算:
[Ca2+ ]i=224(F-Fmin)/(Fmax-F)
1.4.2 血浆游离钙测定[5]
取肝素抗凝血0.5ml封闭送检,全血立即用Radiometer ICA1型游离钙分析仪测定血浆游离钙浓度,pH纠正范围为7.2~7.6。
1.4.3 血小板聚集实验
采用Born比浊法,取2.8%柠檬酸钠1∶6抗凝血,分离PRP与贫血小板血浆(plateletpoor plasma, PPP)并调整血小板数,取PRP2ml SPA-3型聚集仪测定最大聚集度,诱聚剂ADP终浓度为1nmol/L。
1.4.4 病理检查
大体标本按常规制样,血小板分离PRP后1%戊二醛固定电镜检查。
1.5 统计学处理
采用微机处理,实验所得数据作方差分析,结果以均值±标准差表示()。
2 结果
2.1 烧伤后血小板内游离钙变化
烫伤及烧伤后,血小板内游离钙显著高于正常组,并在伤后7天内维持较高水平(P<0.01)。黄磷及磷酸烧伤后血小板内Ca2+ 水平均显著低于正常组(P<0.01),与烧伤组及烫伤组相比,差异亦有非常显著意义(P<0.01),血小板内游离钙呈进行性下降趋势,分别于48小时和72小时降至最低点,且于第120小时有所回升并于168小时反跳升高,明显高于正常对照值(P<0.05)。其中磷酸组血小板内钙的降低出现较早,反跳升高幅度较大。黄磷烧伤及磷酸烫伤后治疗组血小板内钙与未治疗组相比显著升高(P<0.01),与正常组相比差异无显著意义(P>0.05),治疗后8,4,72小时与烧伤及烫伤组比较差异有非常显著意义(P<0.01,表1)。
2.2 烧伤后动物血浆游离钙变化
烫伤及烧伤后,血浆游离钙与正常组相比差异无显著意义(P>0.05),磷酸烫伤及黄磷烧伤组伤后显著降低,伤后8,24小时与正常组、烧伤组及烫伤组比较差异有非常显著意义(P<0.01);磷酸组伤后8小时下降较黄磷组显著(P<0.01),而24小时升高,与8小时比较差异有显著意义(P<0.05);黄磷烧伤组伤后24小时进一步下降,与8小时比较差异有非常显著意义(P<0.01),黄磷烧伤治疗组血浆游离钙在24小时显著高于黄磷组,与正常、烧伤组及烫伤组比较差异无显著意义(表2)。
2.3 磷酸、黄磷致伤后血小板聚集率的改变
烫伤及烧伤后,血小板聚集率与正常组相比差异有非常显著意义(P<0.01),磷酸烫伤及黄磷烧伤组血小板聚集均显著低于正常组(P<0.01),与烫伤及烧伤组比较差异有非常显著意义(P<0.01)。磷酸及黄磷烧伤治疗组动物,在给葡萄糖酸钙治疗后其聚集率与正常组比较无明显差异(P>0.05,表3)。
2.4 病理检查
肉眼、光镜、电镜观察结果与我们既往的研究相同,包括肺、心、肝、肾、脑表现为充血、水肿、出血和上皮、内皮细胞损伤及大量实质性细胞坏死。超微结构显示心肌及肝细胞线粒体肿胀空泡变性,血小板超微结构显示周边模糊不清、管道扩张、微丝及微管结构不清。磷酸烫伤及磷烧伤钙治疗组病理变化明显轻于未治疗组,线粒体形态也基本正常。

表1 烧伤及治疗后血小板游离钙的变化(nmol/L,)
Tab 1 Changes of intracellular free calcium contents in platelets postburn (nmol/L,)

组 别 n 伤后时间(h)
8 24 48 72 120 168
烫伤组 12 452.75±80.81 493.63±69.27 462.92±36.14 504.96±68.81 437.37±84.28 358.76±80.15
烧伤组 12 366.41±85.12 352.46±55.00 487.33±68.16 439.38±43.91 345.56±42.79 383.54±75.84
磷酸组 17 164.04±73.63## 140.36±26.69## 137.85±33.58## 116.95±41.57## 359.22±67.03 421.43±95.01
黄磷组 14 163.04±43.05** 173.23±44.24** 154.89±42.15** 162.04±47.77** 208.07±54.39* 361.03±84.33
酸治组 12 387.10±93.76▲▲ 472.85±71.66▲▲ 359.36±90.03▲▲
磷治组 12 330.73±70.64△△ 219.73±63.59△ 274.55±66.22△△
正常组 16 285.79±43.99

与烫伤组比较:## P<0.01;与烧伤组比较:* P<0.05,** P<0.01;
与磷酸组比较:▲▲ P<0.01;与黄磷组比较:P<0.05,△△ P<0.01

表2 烧伤后血浆游离钙变化(mmol/L,)
Tab 2 Changes of plasma ionic calcium levels postburn (mmol/L,)

组 别 n 伤后时间(h)
8 24
烫伤组 8 1.46±0.12 1.46±0.07
烧伤组 8 1.45±0.14 1.38±0.07
磷酸组 8 0.79±0.16## 1.19±0.04##
黄磷组 8 1.15±0.15* 0.88±0.18**
磷治组 8 1.22±0.18△ 1.37±0.21△△
正常组 8 1.40±0.04

与烫伤组比较:## P〈0.01;与烧伤组比较:* P〈0.05,** P〈0.01;
与黄磷组比较:P〈0.05;△△ P〈0.01;

表3 不同磷剂致伤后血小板聚集率测定(,%)
Tab 3 Results of the rate of platelet aggregation postburn

组 别 n 伤后时间(h)
8 24 72
烫伤组 12 82.13±8.24 77.63±3.42 72.38±4.55
烧伤组 12 84.89±6.34 78.09±1.84 76.88±5.63
磷酸组 17 18.11±3.08## 8.00±1.74## 1.29±0.59##
黄磷组 14 33.04±3.75** 23.82±6.99** 10.79±2.03**
酸治组 12 62.77±8.15▲▲ 60.96±4.88▲▲ 67.14±2.75▲▲
磷治组 12 63.84±4.85△△ 62.68±3.54△△ 65.56±6.20△△
正常组 16 67.01±3.47

与烫伤组比较:## P〈0.01;与烧伤组比较:** P〈0.01;
与磷酸组比较:▲▲ P<0.01;与黄磷组比较:△△ P〈0.01

3 讨论
以往的研究表明,磷酸是磷烧伤后磷中毒的主要原因,由于患者血小板数明显降低,凝血酶原时间正常,因此推断磷酸可能主要影响血小板功能[1,2] 。本组资料显示,磷酸及磷烧伤后血浆游离钙水平不仅显著低于烧伤及烫伤对照组,甚至显著低于正常水平,与此同时,血小板聚集也显著降低,而凝血酶原时间正常(系预实验结果,未列出)。因此,上述结果表明磷烧伤后临床及实验中的出血[1,2] 、广泛性间质出血与血小板内外游离钙浓度降低及血小板聚集改变有密切关系。众所周知,Ca2+ 作为偶联胞外刺激与胞内反应的第二信使,在细胞生理调控中起重要作用,细胞内游离钙浓度的改变是钙信使系统调节细胞各种反应的关键。胞内游离钙参与了血小板活化的各个环节,有学者应用ADP调节血小板内Ca2+ ,当Ca2+ 达一定的阈值时血小板即发生变形可逆性聚集,在升至另一阈值即发生释放反应和不可逆性聚集,可见Ca2+ 是血小板活化的重要条件[6,7] ,此外,Ca2+ 在膜结构维持及血小板收缩过程中也发挥重要作用,磷烧伤后血小板超微结构显示周边模糊不清、管道扩张、微丝及微管结构不清可能与此有关。细胞内钙大部分以蛋白结合方式储存于线粒体、光面内质网、溶质中,当大量磷酸根离子进入胞内时结合钙离子形成磷酸钙,使细胞内钙库的可释放钙减少;同时磷酸根离子在胞内通过钙阻滞作用,降低胞内游离钙水平而导致血小板聚集功能降低。实验结果表明,普通烧伤组血浆游离钙与正常组接近,细胞内钙显著升高,血小板聚集显著升高。我们对氢氟酸研究中也发现(另文发表),氢氟酸烧伤后血浆钙水平显著降低,但其细胞内钙却显著升高,其血小板聚集也明显升高。大量其他研究也表明,细胞内钙与血小板聚集及血栓倾向一致,因此,可以认为磷烧伤后主要是通过磷酸降低细胞内游离钙水平而影响血小板聚集及整体止血功能。
临床上,磷烧伤病人的出血采用止血敏,止血芳酸等药物无效,说明主要影响凝血功能的药物效果不佳,而补充葡萄糖酸钙后则出血迅速停止。本组资料显示,钙治疗组动物血浆及血小板内游离钙水平与正常接近,其血小板聚集功能也恢复正常,说明,补充外源性钙可以通过恢复其细胞内游离钙水平而达到防治磷烧伤病人磷中毒的目的。

致谢: 血浆游离钙检测得到中国协和医科大学协和医院孟迅吾、姚锦芳教授的协助

参 考 文 献

1 胡安军,杨智义,刘新明,等.静脉滴注葡萄糖酸钙治疗磷烧伤.中华外科杂志, 1993,31:421-424.
2 胡安军,杨智义,刘新民,等.钙剂防治磷烧伤中毒的临床效果.中华整形烧伤外科杂志.1993,9:254-256.
3 夏淑芳,黎鳌,朱佩芳,等.大白鼠磷烧伤和凝固汽油烧伤模型制作.第三军医大学学报,1989,11:450-452.
4 Grynkiewicz G, Poenie GL, Tsien RY. A new generations of Ca indicators with greatly improved fluorscence properities. J Bio Chem,
1985,260:340-344.
5 孟迅吾,邢小平,谭舒文,等.血游离钙浓度测定的初步临床应用.中华内科杂志, 1993,32:665-667.
6 Rink TJ, Smith SW, Tsien RY, et al. Cytoplasmic free Ca in human platelet: Ca thersholds and Ca independent activation for shape change and secretion. FEBS LEtt, 1982, 148:21-24.
7 Erik H, Murer. The role of platelet calcium. Semin Hemato, 1985,22: 313-315.

收稿:1997-05-29 修回:1997-08-30

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