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编号:10653496
IGF2和H19基因与儿童胚细胞恶性肿瘤的关系
http://www.100md.com 《中华小儿外科杂志》 1998年第1期
冯雪莲 蔡玲玲 马汝柏 刘荻 林久治 100020 北京, 首都儿科研究所病理研究室(冯雪莲、蔡玲玲、刘荻、林久治), 外科(马汝柏) 中华小儿外科杂志 1998 0 19 1
关键词:染色体缺失;肾母细胞瘤;神经母细胞瘤 期刊 zhxrwkzz 0 临床研究 fur -->


摘要 目的: 探讨儿童胚细胞起源的恶性肿瘤的发生与IGF2和H19基因胚胎印迹缺失(LOI)的关系及肿瘤时这两个基因之间的协同关系。 方法: 通过PCR-RFLP法和Northern blot法检测包括6例肾母细胞瘤、 2例神经母细胞瘤和2例内胚窦瘤在内的10例儿童胚细胞起源的恶性肿瘤中IGF2和H19基因的LOI及H19基因的mRNA表达。 结果: ① 三种肿瘤中均可检测到频发的IGF2基因的LOI, H19基因的LOI相对少见; ② 肾母细胞瘤中发生IGF2基因LOI的病例全部伴有H19基因mRNA的低水平表达。 结论: IGF2基因的LOI与儿童胚细胞起源的恶性肿瘤的发生有密切关系, 而这两个基因的相互协同作用可能是肾母细胞瘤发病的重要因素之一。


Relationship of IGF2 and H19 Genes in Children with Embryogenic Cancers Feng Xuelian, Cai Lingling, Ma Rubo, et al. Dept. of Pathology, Capital Institute of Pediatrics, Beijing 100020

Abstract Objective: To investigate the relationship of the loss of imprinting (LOI) of insulin-like growth factor-2 (IGF-2) and H19 gene with tumorigenisis of childhood embryogenic cancers and their coordinative effects. Methods: LOI of IGF2 and H19 genes, and mRNA expression of H19 gene were examined on 10 cases of embryogenic cancers including Wilms tumors (6), Neuroblastomas (2) and Yolk sac carcinomas (2) by PCR-RF
LP and Northern blot methods. Results: LOI of IGF2 always appeared in the above tumors while LOI of H19 was less frequent, and LOI of IGF2 was detected in association with reduced H19 mRNA expression in Wilms tumor. Conclusions: LOI of IGF2 may be associated with tumorigenesis of embryogenic cancers and IGF2 worked in coordination with H19 genes may play animportant role in the incidence of Wilms tumor.

Key words Chromosome deletion Nephroblastoma Neuroblastoma

IGF2(insulin-like growth factor-2)和H19基因是正常人胚胎组织中表现为印迹特征的一对基因[1] , 其中, IGF2单一表达父系的等位基因[2] , H19单一表达母系的等位基因[3,4] 。 已经有报道, 在一些儿童肿瘤时, 它们的胚胎印迹缺失(loss of imprinting, 简称LOI)为双等位基因表达, 并且这种遗传学上的改变可能与肿瘤的发生、 发展有关。肾母细胞瘤、 内胚窦瘤和神经母细胞瘤均起源于胚胎组织, 是儿童常见的恶性肿瘤。 为了进一步探明它们的发生与这两个基因的胚胎印迹紊乱的关系, 我们检测了这三种肿瘤中IGF2和H19基因的LOI以及H19基因的mRNA表达水平。

材料与方法

1. 标本均来自本院外科手术切除的初发病例的-80 ℃冷冻保存组织。 其中, 肾母细胞瘤6例、 内胚窦瘤2例、 神经母细胞瘤2例。

2. 按常规方法提取、 纯化DNA。

3. ISOGEN总RNA提取液(日本和光制药株式会社)提取、 纯化RNA。

4. LOI检测: 首先, 基因组DNA进行PCR扩增, 然后通过IGF2和H19基因上已知的DNA限制性转录多态性酶切位点来筛选杂合子的病例(PCR-RFLP法)[2,3] , 对这些病例进一步检测其cDNA产物的等位基因的表达。 正常时这两个基因均为单等位基因表达, 如果在cDNA产物中同时检测到两条等位基因表达, 即表明存在胚胎印迹缺失现象。 具体方法如下: ① IGF2基因检测一个ApaI切点的多态性。 PCR扩增用引物见文献[2]。 PCR反应液中加入10%二甲砜, 延伸温度为60 ℃,共35个循环。 20单位Apa I限制性内切酶酶切过夜, 10%聚丙烯凝胶电泳、 溴化己啶染色。② H19基因检测一个Rsa I切点的多态性。 引物序列: 5-TACAACCACTGCACTACCTG-3和5-TGGAATGCTTGAAGGCTGCT-3。 PCR扩增及酶切条件同上。 ③ 5 μg总RNA经DNase I 37 ℃60分钟处理后, 采用逆转录试剂盒(GIBCO BRL)合成cDNA。 逆转录温度为37 ℃, RT-PCR引物同上, 产物分别用Apa I和Rsa I酶切。 为了排除DNA污染造成的假阳性, 在RT-PCR扩增时, 用完全相同的反应液同时扩增未进行逆转录的RNA作为对照。

5. Northern blot检测: 10 μg总RNA于1.3%凝胶电泳后转移至纤维素膜上。 正常对照组织为1例2岁幼儿的正常肾脏, H19探针用上述RT-PCR产物, GAPDH基因作对照杂交。 32 P-α dATP标记,预杂交和杂交温度为42 ℃, 1XSSC/0.1%SDS 42 ℃15分钟洗膜后放射自显影。 杂交带浓度测定用Bas 2000放射线浓度检测仪(Fuji Photo Film Co, Tokyo)进行检测[5]

结果

1. LOI检测: IGF2基因的PCR产物经Apa I消化后, 7例可见a、 b两个片段(未被消化的为a片段,被消化的为b片段), 3例仅见a或b单一片段。 表明前者在IGF2存在Apa I酶切位点的转录多态性。RT-PCR法检测这7例病例, 5例cDNA产物同时表达双等位基因(图1)。 H19的检测结果, 10例中,
7例表现为Rsa I切点的转录多态性的病例, 其中2例cDNA产物同时表达双等位基因(图2)。


a:未被Apa I酶消化的片段,b:被Apa I酶消化的片段
图 1 基因组DNA检测IGF2基因的Apa I酶
切位点的转录多态性(上图)和RT-PCR产物经
Apa I酶切后检测IGF2的等位基因表达(下图)

a:未被Rsa I酶消化的片段,b:被Rsa I酶消化的片段
图 2 基因组DNA检测H19基因的Rsa I酶
切位点的转录多态性(上图)和RT-PCR产物经
Rsa I酶切后检测H19的等位基因表达(下图)

2. Northern blot检测: 我们检测了H19基因mRNA的表达。 结果显示: 放射自显影在1周时,正常肾和6例瘤组织在2.2kbp处可见清楚的杂交带, 而病例2、 11、

附表IGF2和H19基因在10例儿童肿瘤中的等位基因表达

病例 性别 年龄

(岁)

诊 断 IGF2/Apa I H19/Ras I Northern blot
DNA RNA DNA RNA H/G TH/TH(%)

NH/NG(%)

3 7 神经母细胞瘤 a/a a/- a/b a/b 4.4 84.6
5 4 神经母细胞瘤 a/b a/b a/b a/b 4.5 86.5
13 4 内胚窦瘤 a/b a/- a/b -/b 4.6 88.5
16 3 内胚窦瘤 a/b a/b a/a a/- 7.8 150.5
2 6 肾母细胞瘤 a/b a/b a/a a/- 0.5 9.6
4 6 肾母细胞瘤 a/b a/- a/b a/- 4.5 86.5
11 5 肾母细胞瘤 a/b a/b a/b -/b 0.3 5.8
15 2 肾母细胞瘤 a/a a/- a/a a/- 0.4 7.7
17 2 肾母细胞瘤 a/a a/- a/b -/b 3.9 75.0
18 6 肾母细胞瘤 a/b a/b a/b a/b 0.3 5.8
对照 2 正常肾 a/b a/- a/a a/- 5.2 100.0
 注: a/b: 杂合子; a/a: 纯合子; a/-: 单一表达a等位基因; -/b: 单一表达b等位基因, T: 肿瘤组织, N: 正常组织; H: H19基因, G: GAPDH基因15、 18未见到杂交带(均为肾母细胞瘤)(图3)。 放射自显影两周以上时, 这4例在2.2 kbp处才见微弱的杂交带。 用Bas 2000仪测定, 以正常对照组织的H19基因杂交带与GAPDH基因杂交带的放射强度比值作为100%, 通过肿瘤的H19/GAPDH与正常组织的H19/GAPDH的比值来测算H19基因的mRNA表达水平, 这4例的H19基因mRNA表达低于正常的10%(附表)。图 3 Northern blot检测H19基因表达, 4例肾母细胞瘤(例2、11、15、18)的表达明显低下    
  讨 论    IGF2和H19基因定位的11 p 15.5处是一个在一些儿童散发性肿瘤和BWS(Beckwith-Wiedemann syndrome)综合征时频繁发生异常的染色体区域[1,6]  。 因此, 这对基因的非正常灭活和激活与儿童肿瘤发生的关系也受到关注。 IGF2基因的LOI在肾母细胞瘤、 横纹肌肉瘤和肝母细胞瘤已见报道[1,7]  。 我们试图通过更进一步的研究来探讨IGF2的LOI是否为儿童胚细胞起源一类肿瘤的病理遗传学特征, 因此本研究除了肾母细胞瘤之外, 还同时检测了尚未见报道的内胚窦瘤和神经母细胞瘤这两种儿童常见的胚细胞来源的肿瘤。 结果提示, 三种肿瘤中均存在IGF2基因的LOI, 表明IGF2的LOI作为这类肿瘤的病理遗传学特征之一的可能性很大, 而IGF2作为一个增殖因子[6~8]  , 在LOI时很可能是通过激活一条正常非表达的母系等位基因而使细胞内癌基因水平增高, 导致细胞向癌化的方向发展。 H19是一个抑癌基因[6,7]  ,它在肾母细胞瘤中的LOI发生率约为29%[7]  。本组也只检测到1例肾母细胞瘤和1例神经母细胞瘤的LOI。目前还不清楚这两例LOI是偶然的印迹松弛,还是与其他的致癌机制有关,但是从这种低LOI发生频率的事实可以设想它在癌变过程中也许存在另外的灭活机制。 我们的Northern blot结果显示, 10例肿瘤中4例H19基因表达明显低下, 表明肿瘤时该基因的低表达可能比LOI更有意义。 另外, 我们检测到的H19表达低下的病例全部为肾母细胞瘤, 发生率高达66.7%。 这是否提示H19基因的表达抑制与肾母细胞瘤的发生有直接关系?值得提出的是, 肾母细胞瘤中被检测到的3例IGF2 LOI的病例, 均伴有H19基因的低表达。 提示这两个基因在其致癌作用上是相互关联的。 有的学者曾提出IGF2/H19之间可能存在偶联倒转(inverse coupling)的假说[7,9]  , 即肿瘤时H19正常表达的母系等位基因被灭活而IGF2正常表达的母系等位基因被异常地激活。 我们的实验结果表明这一假说与肾母细胞瘤是相符合的, 而在另外两种肿瘤中却未能得到相应的证据。 本研究初步证明了IGF2基因的LOI与儿童恶性肿瘤发生的关系, 而H19和IGF2基因的协同作用可能是肾母细胞瘤发病的重要因素之一。   志谢: 感谢日本新泊舄大学脑研究所分子神经病理学部门教授熊西敏郎先生对这项研究的指导和援助。    

参考文献

1  Rainier S, Dobry CJ, Feinberg AP. Loss of imprinting in hepatoblastoma. Cancer Res, 1995, 55:1836-1838.2  Giannoukakis N, Deal C, Paqutte J, et al. Parental genomic imprinting of the human IGF2 gene. Nature Genetics, 1993, 4:98-101.3  Zheng Y, Tycko B. Monoallelic expression of human H19 gene. Nature Genetics, 1992, 1:40-44.4  Rainier S, Johnson LA, Dobry CJ, et al. Relaxation of imprinted genes in human cancer. Nature, 1993, 362:747-749.5  Jinno Y, Yun K, Nishiwaki K, et al. Mosaic and polymorphic imprinting of the WT1 gene in humans. Nature Genetics. 1994, 6:305-309.6  Feinberg AP. Genomic imprinting and gene activation in cancer. Nature Genetics, 1993, 4:110-113.7  Steenman MJC, Rainier S, Dobry CJ, et al. Loss of imprinting of IGF2 is linked to redued expression and abnormal methylation of H19 in Wilms tumour. Nature Genetics, 1994, 7:433-439.8  Morison IM, Becroft DM, Taniguchi T, et al. Somatic overgrowth associated with overexpression of insulin-like growth factor Ⅱ. Nature Medicine, 1996, 2:311-316.9  Moulton T, Crenshaw T, Hao Y, et al. Epigenetic lesions at the H19 locus in Wilms tumour patients. Nature Genetics, 1995, 7:440-447.    
(收稿: 1997-04-12  修回: 1997-12-02)    
, 百拇医药