关键词：尿道下裂；受体；雄激素；基因
摘 要：目的 研究尿道下裂的发生与雄激素受体基因突变间的关系。方法 运用盐析法从27例不同类型尿道下裂患儿外周血中提取基因组DNA，然后通过聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)银染色法检测雄激素受体基因第2和第8外显子基因突变情况。结果 1例会阴型尿道下裂合并双隐睾、1例阴茎阴囊型尿道下裂患儿检出雄激素受体基因第8外显子突变，未发现第2外显子存在基因突变。结论 雄激素受体基因突变可能与尿道下裂的发生有关,并可能与严重尿道下裂的发生关系更为密切。
Androgen receptor genemutation in children with hypospadias
WANG Jun, YUAN Jiyan, ZHOU Xuefeng
(Department of Pediatric Surgery, The Affilated Tongji Hospital, Tongji MedicalUniversity, Wuhan 430030, China)
Abstract： Objective To evaluate the status ofandrogen receptor gene in children with hypospadias.Methods Genomic DNA were extracted fromperipheral blood leucocytes of 27 boys with various degree of hypospadias. Androgenreceptor gene mutations (exons 2 and 8) were identified by silver staining ofsingle-strand conformation polymorphism analysis of polymerase chain reaction (PCR-SSCP). Results Of them, 2 patients with severehyposp adias (one with perineal hypospadias and bilateral cryptorchidism, one withpenoscrotal hypospadias) were found exon 8 androgen receptor gene mutation. No exon 2mutation was found.Conclusion Mutation of androgene receptor gene may be ass ociatedwith severe hypospadias.
Key words ： Hypospadias； Receptor, Androgen； Genes▲
尿道下裂是小儿泌尿生殖系最常见的先天性畸形之一，在其发病原因中雄激素受体(androgen receptor, AR)缺陷日益为人们所重视，并已深入到AR基因突变的研究[1] 。本文应用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)银染色法分析尿道下裂患儿AR基因突变情况，以探讨尿道下裂的发生与AR基因突变间的关系。
材料与方法
一、标本来源及基因组DNA提取
27例尿道下裂患儿中，阴茎头型3例，阴茎干型11例，阴茎阴囊型8例(其中1例合并有右隐睾)，会阴型5例(其中2例合并有双隐睾)。患儿年龄1.5～14.0岁，平均7.9岁。所有患儿染色体核型为46，XY。对照组为健康、无外生殖器异常及内分泌疾病的正常儿童30例。上述实验对象取外周静脉血3ml，加EDTANa2 抗凝,盐析法提取基因组DNA。
二、聚合酶链反应(PCR)
引物序列依据文献[2] ，由Gibco BRL公司合成，其碱基序列为：Exon2：Forward 5′-GCCTGCAGGTTAATGCTGAAGACC-3′,Reverse 5′-CCTAAGTTATTTGATAGGGCCTTGCC-3′ ;Exon 8：Forward 5′-GAGGCCACCTCCTTGTCAACCCTG-3′, Re-serve 5′-GGAACATGTTCATGACAGACTGTACA
-TCA3′。
50μl PCR反应体系组成：10×Buffer 5μl，10mmol/L dNTP 1μl，引物一对，各16pmol， MgCl2 1.5mmol/L，Taq酶2U，加双蒸水至48μl，再加模板DNA2μl，混匀后 石 蜡油覆盖。有关PCR扩增特异性循环参数为：94℃，30s；57℃，1min(第8外显子为59℃)；72℃ ，1min。35个循环后72℃延伸5min。
取PCR扩增产物6μl经质量分数为2%琼脂糖凝胶电泳检测。
三、单链构象多态性(SSCP)分析
取PCR扩增产物5μl与等体积的变性液(体积分数为95%去离子甲酰胺、10mmol/LEDTA pH8.0，质量分数为0.05%溴酚蓝，0.05%二甲苯蓝)混合，100 ℃变性5min，冰中骤冷，迅速加样，进行质量分数为6%(49∶1)非变性聚丙烯酰胺凝胶(胶块大小为16cm×30cm×0.06 cm)，室温下电泳(胶中含体积分数为10%甘油)。预电泳10w,30min；电泳10w，至指 示剂溴酚蓝走至凝胶下缘(约4～6h)停止电泳，然后剥胶进行银染色。
凝胶银染色步骤为：①体积分数为10%冰乙酸中固定15min；②银染色液(质量分数为0.15%AgNO3 )中平缓摇动染色15～20min；③显色液(质量分数为3%Na2 CO3 、体积分数为0.15%甲醛、质量分数为0.25%Na2 S2 O3 )中显色至条带显示清晰；④终止液(体积分数为10%冰乙酸)中终止显色反应。每一步骤后均用双蒸水冲洗凝胶。
结 果
一、雄激素受体基因第2、8外显子PCR扩增结果
第2外显子和第8外显子扩增片段大小分别为379bp、347bp,其扩增条带单一,且位于相应的分子量标准内。
二、SSCP分析结果
对照组与病例组的DNA经PCR扩增后在同样条件下SSCP电泳和银染色，若同一块胶中病例组与对照组相比，出现电泳带的加、减或位置的移动，即说明该样品存在着突变的基因。结果：发现2例患儿存在AR基因第8外显子突变，他们分别为1例会阴型尿道下裂合并有双隐睾、1例阴茎阴囊型尿道下裂，均无家族史；未检出第2外显子突变。
讨 论
正常情况下，染色体核型为46，XY的胎儿于胚胎第5周起在其体内最重要的两种雄激素--睾酮和双氢睾酮(DHT)作用下，其外生殖器和尿道开始发育[3] 。在此过程中，如AR缺陷(AR缺失、数量减少或结构异常)则影响睾酮、DHT发挥其生物学效应而使前尿道发育不全，导致尿道异位开口于阴茎腹侧而形成尿道下裂。正因为如此，Wiener等[4] 将单纯性尿道下裂划归于雄激素不敏感综合征(AIS)2型，将严重尿道下裂合并小阴茎、隐睾或阴囊对裂划归于AIS 3型。国内李春等[5] 亦认为先天性尿道下裂属于AIS的范畴。
AR缺陷的原因和AIS的最常见原因均是AR基因的缺陷。回顾性研究表明[6] ：AR基因缺陷绝大多数为AR基因的点突变(约为全部AIS患者的92%)，并且尽管AR基因的8个外显子均可出现点突变，但仍以激素结合阈和DNA结合阈内的点突变更为频繁。作为一种广泛应用于未知基因的突变分析和临床检测的技术方法，PCR-SSCP银染色法具有简便、灵敏、无害等特点[7] ，又由于第2、8外显子分别位于AR基因的DNA结合阈和激素结合阈，所以我们应用此方法分析27例不同类型尿道下裂患儿AR基因第2、8外显子突变情况。实验结果显示1例会阴型尿道下裂合并有双隐睾患儿及另1例阴茎阴囊型尿道下裂患儿第8外显子出现泳动变位，即存在基因突变，未检出第2外显子基因突变。根据Albers等[8] 的观点，此2例患儿属于严重尿道下裂患儿。这一方面提示AR基因突变可能与一部分患儿发生尿道下裂有关，另一方面也说明AR基因突变更多地存在于严重尿道下裂的发生中，这可能与严重尿道下裂常合并有会阴部其他畸形(隐睾、小阴茎、阴囊对裂等)有关。因此我们认为AR基因突变可能与尿道下裂的发生有关，并可能与严重尿道下裂的发生关系更为密切。
总结目前国外学者关于尿道下裂患儿AR基因突变研究方面的文献，发现以激素结合阈出现点突变较多。从本实验的结果看，我国尿道下裂患儿也主要是以此区阈发生突变为多见。以DNA为基础的AR基因碱基突变必将引起AR功能的改变。许多研究[9] 认为，若AR基因的激素结合阈出现点突变则可导致AR与雄激素的结合亲和力下降、AR热不稳定性和雄激素从受体上解离速率加快或激素-受体复合物的稳定性下降等方面的缺陷。从此意义上看，国内蒋学武等[10] 的关于尿道下裂患儿阴茎AR的研究与本研究有着内涵上的一致性，即一部分尿道下裂患儿体内雄激素水平和生殖器AR数量正常，但由于存在AR基因突变导致AR结构异常使雄激素与AR结合缺陷(两者不能结合或结合力低下)而引起尿道下裂。本组2例突变患儿AR结合力尚有待于进一步研究。
参考文献：
[1]王军,袁继炎.尿道下裂病因学研究进展.中华小儿外科杂志,1998,19：371-373
[2]Lubahn DB,Brown TR,Simental JA,et al. Sequence of the intron/exon junctions of thecoding region of the human androgen receptor gene and identification of a point mutationin a family with complete androgen insensitivity. Proc Natl Acad Sci USA, 1989,86：9534-9538.
[3]Belman AB.Hypospadias.In：Welch KJ,Randolph JG,Ravitch MM,et al.eds.PediatricSurgery.4th ed. London：Year Book Medical Publishers，1986.1286-1302.
[4]Wiener JS,Teague JL,Roth DR,et al. Molecular biology and function of the an drogenreceptor in genital development. J Urol, 1997,157：1377-1386.
[5]李春,谢家伦,卢汉平.先天性尿道下裂阴茎皮肤细胞雌雄激素受体表达与胞核内的聚集.中华小儿外科杂志,1998,19：275-278.
[6]Quigley CA,DeBellis A,Marschke KB,et al. Androgen receptor defects：historical,clinical, and molecular perspectives. Endocr Rev, 1995,16：271-321.
[7]Hayashi K. PCR-SSCP：a simple and sensitive method for detection of mutations inthe genomic DNA. PCR Methods Appl , 1991,1：34-38.
[8]Albers N,Ulrichs C,Gluer S,et al. Etiologic classification of severe hyposp adias：implicationsfor prognosis and management. J Pediatr, 1997,131：386-392.
[9]崔毓桂,张桂元. 雄激素受体的结构和功能.国外医学计划生育分册，1994,13：201-205.
[10]蒋学武,陈绍基,王光义,等.先天性尿道下裂阴茎雄激素受体的研究.中华小儿外科杂志,1995,16：141-142.
收稿日期：1999-04-22 , http://www.100md.com
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