应用增强化学发光法分型检测肠毒素大肠埃希菌
关键词：
肠毒素大肠埃希菌(ETEC)是引起人畜急性感染性腹泻的重要病原体。与人类腹泻密切相关的是不耐热肠毒素h(LTh)、耐热肠毒素Ⅰb(STⅠb)及耐热肠毒素Ⅰa(STⅠa)三种肠毒素菌株。我们利用一种新型的核酸探针标记和检测技术，建立了用辣根过氧化物酶(HRP)标记ETEC三种基因探针及通过增强化学发光法检测三种肠毒素基因并分型的方法，取得较好结果。一、材料和方法1.菌株：实验用各种ETEC及其他肠道细菌如肠出血性大肠埃希菌、肠侵袭性大肠埃希菌、伤寒沙门菌、鲍氏志贺菌等来自军事医学科学院五所或本室保存。2.探针的制备：含LTh-STⅠa-STⅠb三价基因片段的质粒pKAD008由军事医学科学院五所赠送，含LTh-STⅠb二价基因片段的质粒由本室构建。用碱变性法提取质粒，经限制性内切酶酶切，低熔点琼脂糖法回收LTh-STⅠa-STⅠb三价、LTh-STⅠb二价和LTh单价基因片段。将回收的基因片段稀释成10 ng/μl～20 ng/μl，100℃变性10分钟，冰浴5分钟，再加入等体积的HRP标记复合物和0.4%戊二醛，混匀后置37℃反应15～30分钟，4℃备用。4.狭缝杂交DNA膜和菌落杂交膜的制备：按常规方法进行，用于测定探针敏感性和特异性。5.临床标本的收集与处理：收集1 976份急性腹泻粪便标本，经SS、麦康凯培养基和庆大霉素琼脂平板分离培养，623份为大肠埃希菌致泻标本。将粪便用磷酸盐缓冲液制成10%悬液，500 r/min离心30分钟，取上清液6 000 r/min，离心15分钟，收集菌体物，直接点种于膜上，贴于LB琼脂平板，37℃培养过夜。按菌落杂交膜制备方法处理膜，待杂交。6.杂交、发光和显影：增强化学发光法检测试剂购自北京医科大学血液病研究所，操作按说明书进行。7.α-32 P标记基因探针的制备及杂交：探针标记参照缺口平移标记试剂盒(Promega公司)说明书进行，杂交方法按常规进行。二、结果1.增强化学发光法检测ETEC的敏感性和特异性：将10倍系列稀释的质粒(pKAD008)DNA点膜杂交，结果酶标三价、三价及LTh基因探针均能检测到0.1 pg的质粒DNA。α-32 P标记的基因探针也能检测到0.1 pg的质粒DNA。标准菌株的菌落杂交结果表明，酶标三价探针能与产LTh、STⅠa和STⅠb肠毒素的菌株杂交，二价基因探针能与产LTh和STⅠb肠毒素的菌株杂交，LTh单价基因探针能与产LTh菌株杂交，三种探针与非ETEC菌株均无杂交信号。2.临床粪便标本的检测：用建立的方法检测623份大肠埃希菌致泻粪便标本，结果有242份为ETEC阳性。用三价、二价和单价基因探针分别检测同一份标本，结果三种探针同时阳性的142份(为LTh感染或LTh合并ST感染)，三价和二价两种探针阳性的28份(为STⅠa感染或STⅠa合并STⅠb感染)，仅三价探针阳性的72例(为STⅠb感染)。三、讨论增强化学发光法是近年来兴起的一种新型非放射性标记及检测技术，原理是HRP酶标复合物在戊二醛的作用下与单链DNA探针形成共价复合物，在过氧化氢存在时，HRP催化发光底物鲁米诺发光，光亮子在酚、萘及胺类等增强剂促进下得到增强，可用普通X光胶片进行自显影。与同位素及其他非放射性标记物相比，具有以下优点：探针标记和发光过程所需时间短，简便快速；无放射性污染，安全不需特殊防护；标记效率高，标记好的探针可保存半年；杂交膜4℃保存可反复使用，无需特殊处理，即可在同一膜上进行不同探针的多次杂交(这尤其适用于本研究的三种探针分型检测)。用HRP复合物标记肠毒素基因并通过ECL检测ETEC，敏感性试验此探针可测到0.1 pg质粒DNA，与同位素标记探针的敏感性一致，特异性检测能与相应的肠毒素基因杂交，表明此方法有较好的敏感性和特异性。我们将HRP标记的LTh-STⅠa-STⅠb三价探针、LTh-STⅠb二价探针及LTh单价探针联合使用，检测临床腹泻患者粪便标本中的ETEC并间接地进行肠毒素基因分型，获得满意结果。本方法的建立为ETEC感染的临床诊断及分子流行病学调查提供了一种快速简便、安全可靠、敏感特异的检测手段。
(收稿：1997-01-13 修回：1997-06-16)
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