增菌法分离嗜肺军团菌的研究及应用

http://www.100md.com 《中华医学检验杂志》 1998年第2期

彭晓旻 严寒秋 王凤荣 裴红生 吴佳丽 100013 北京市卫生防疫站流行病科 中华医学检验杂志 1998 3 21 2
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嗜肺军团菌 (Legionella pneumophila, LP)常引起人类军团菌肺炎散发和暴发。在临床诊断和流行病学调查中，病原体 LP的分离较重要。国内外常用分离方法^{[ 1， 2]} 操作过程复杂、酸预处理抑制 LP生长、标本中含菌量少、杂菌抑制等诸因素导致阳性检出率低。本实验建立的增菌法分离 LP和研制的选择性增菌培养基 (ABYE)，可提高阳性分离率和减少常规分离方法实验步骤。
一、材料与方法
1.培养基：( 1)选择性增菌培养液 (ABYE)：基础增菌液 (BYE)无菌加入万古霉素 1 μ g / ml，多粘菌素 B 20 U/ ml，放线菌酮 8 μ g / ml分装备用。 BYE成分：氨基乙酸 3 g/L,酵母粉 10 g/L,ACES 10 g/L,KOH 2 g/L,焦磷酸铁 250 mg/L,L-半胱氨酸盐 400 mg/L， pH 7.0。 (2)Oxoid公司生产的生长培养基( BCYE)。( 3)常规分离用选择性培养基( GVPC)及各种生化反应培养基自制^{[ 1]} 。
2.标准菌株及试剂： LP标准菌株分别为 ATCC33152、 ATCC33154、 ATCC33155、 ATCC33156、 ATCC33216、 ATCC33215、 ATCC33823、 ATCC35096源于流行病学学研究所。聚合酶链反应 (PCR)试剂、地高辛标记探针杂交检测试剂盒分别为华美、 BM公司产品。
3.标本：临床标本 28份，环境标本 108份，共 136份。
4.方法：( 1)纯培养及菌液浓度测定： LP标准菌经 BCYE 烛缸中 37℃培养 48小时后获纯培养。 LP纯培养经无菌蒸馏水制成悬液， 10倍系列稀释后取 0.1 ml接种 BCYE ，无菌三角棒均匀涂布，每种浓度 2块平板，培养 48小时后计数菌落平均数。根据稀释倍数计算菌液中所含活菌数，即菌液浓度 CFU / ml。( 2) BYE 对各型 LP标准菌增菌效果：定性试验：接种适量浓度的各型菌悬液 0.1 ml于 BYE培养 48小时混匀后观察生长液浊度。定量试验：选择 LP1型标准菌按方法( 1)测定培养前后菌液浓度，计算增菌倍数。( 3) ABYE中抗菌素浓度对 LP 生长影响：制备含万古霉素、多粘菌素 B、放线菌酮不同浓度的 ABYE ，将一定浓度的 LP1菌液 0.1 ml分别接种含不同抗生素浓度的 ABYE 中，按方法( 1)测培养后的 ABYE 菌液浓度，观察抗生素浓度对 LP生长的不同影响。( 4)增菌法的建立：将 2 ml标本无需处理接种 ABYE， 37℃烛缸中选择性增菌培养 48小时后取 0.1 ml培养液转 BCYE 划线培养， 48小时后挑取可疑菌落鉴定。( 5)常规法^{[ 1， 2]} ：将 2 ml标本等量酸处理 15分钟，再用等量碱中和后取 0.1 ml接种选择性 GVPC 平板，培养 72小时后挑可疑菌落分纯。( 6)分离菌株鉴定，计算两法阳性率及χ ² 分析。
二、结果与讨论
1.接种 10⁵ CFU/ ml各型 LP标准菌 0.1 ml于 BYE培养后，肉眼可见明显混浊。定量实验测定经 BYE增菌后浓度为 6×10¹⁶ CFU/ ml，增菌倍数约 10¹¹ 。附表显示 3种抗生素浓度对 LP生长影响，其中多粘菌素 B影响最大，选择 20～ 40 U/ml适宜。

附表 抗生素浓度对 LP生长影响

2.两法检测136份标本，其中6株分离菌与标准菌有相同的形态及生化反应特点，血清学和直接免疫荧光抗体实验显示为LP1、2、4、9血清型菌株。经PCR检测产生与标准菌相同的基因扩增产物，用地高辛生物素标记的探针经斑点杂交检测扩增产物均阳性。增菌法阳性检出率3.7%(5/136)，常规法阳性率0.7%(1/136)。χ² 检验，P <0.05，两法差异有显著性，增菌法优于常规法。
3.应用增菌法分离LP，直接对标本选择性增菌，省略了常规法中既繁琐又抑制LP生长的酸处理过程，操作简便易行，阳性分离率较高。抗生素可抑制和杀灭杂菌，但其种类和浓度均影响LP生长，建议实验中视标本污染程度定量。增菌培养基可用于标本运送，特别适合临床呼吸道标本现场采样直接分离。

参考文献

1 武建国主编.军团菌病.南京：东南大学出版社，1990.93-135.
2 ReinthalerFF, Sattler J,Karin SD, et al. Comparative study of procedures for isolation andcultivation of Legionella pneumophila from tap water in hospitals. J Clin Microbiol,1993,31:1213-1316.

(收稿：1997-05-23 修回：1997-08-21)

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