关键词：淀粉样β-蛋白；白细胞介素1；神经组织蛋白质S100；阿尔茨海默病
【摘要 】 目的 在体条件下观察β-淀粉样蛋白(Aβ)对白细胞介素-1β(IL-1 β)和神经组织蛋白(S100β)表达的影响，探讨三者之间的相互关系。方法 以不同浓度Aβ溶液及生理盐水作海马立体定向注射后，采用免疫组织化学、HE染色及刚果红染色方法，显示胶质细胞反应及IL-1β、S100 β表达情况，并在高倍显微镜下(×400)进行阳性细胞计数，方差分析和等级相关分析作显著性检验。结果 胶质细胞反应程度及IL-1 β、S100 β的表达水平随Aβ浓度增大而增加，4μg/μl Aβ溶液注射组IL-1 β、S100 β阳性细胞数(个/视野)分别为41.75±2.61和42.39±3.46，显著多于生理盐水组(21.16±2.92和34.50±3.57)，P<0.01；S100 β+ 与IL-1β+ 细胞数存在较强的相关性(rs =0.892)。 结论 在体条件下高含量Aβ强烈诱导胶质细胞IL-1β和S100β的表达，结果提示三者之间的相互作用在Alzheimer病发病机制中有重要作用。
Changes of interleukin-1 β andS100 β expression after β-amyloid injection into hippocampus
LIN Yu CHEN Junpao, LIU Lingjuan, et al
Department of Neurology, Zhujiang Hospital, The First Military Medical University,Guangzhou 510282, China
【 Abstract 】 Objective To observe the effection ofβ-amyloid (Aβ) on interleukin-1 β(IL-1 β) and S100 β expression in vivo and toexplore the relations among Aβ, IL-1 β, and S100 β. Methods One weekafter sterotaxis injection into CA1 subregion of hippocapus with differentdoses of Aβ and normal saline, we evaluated the gliacyte reaction and the expression ofIL-1 β and S100 β by means of immunohistochemical assay, hematoxylin-eosin staining,andCongo red staining. IL-1 β and S100β positive cells were counted in four microscopicfields at a magnification of 400 times,and assessed for statistical significance withone-way analysis of variance and Spearman′s rank correlation coefficient. Results The gliosis level and the numbers of IL-1 β and S100 β positive cells increased withelevation of Aβ dosage.Furthermore,the expression of S100 β was remarkably correlatedwith the IL-1 β level (r=0.892, P<0.001). Conclusions Aβ couldinduce gliacytes high expression of IL-1 β and S100 β in vivo. It suggested that thesynergisms among the three proteins were important in the pathogenesis of Alzheimer′sdisease.
【 Keywords 】 Amyloid beta-protein;Interleukin-1;Nerve tissue protein S100;Alzheimer disease
随着Alzheimer病(AD)分子机理研究的深入，β-淀粉样蛋白(Aβ)作为一种致病因子颇受关注。近年来，越来越多的证据显示，由Aβ诱发的慢性炎症反应是介导神经元损伤的主要途径[1] ，而老年斑周围的神经胶质细胞及其分泌产物在这一机制中起主要作用。对AD病人的病理检查结果证实，海马各亚区白细胞介素-1β(IL-1 β)和神经组织蛋白(S100β)呈高表达，并认为它们是介导神经元和胶质细胞相互作用的桥梁。体外研究表明，Aβ与IL-1β及S100β之间存在密切的相关性；然而在体实验资料尚不多见。本实验采用海马立体定向注射技术，观察Aβ对IL-1β和S100 β表达的影响，进一步探讨它们之间的关系及其在AD发病机制中的作用。
材料和方法
1. 实验分组：雄性SD大鼠48只(由第一军医大学实验动物中心提供)，鼠龄8～12周，体重250～300g，常规环境饲养。随机分为假手术组和5个注射组，后者注射容量均为1μl，Aβ1-40 的浓度分组为1、4、7、10 μg/μl共4组，注射生理盐水1μl作为对照，每组各8只大鼠。
2. Aβ1-40 的孵育：用无菌生理盐水将Aβ1-40 稀释成10μg/μl，37℃孵育1周，使其变为聚集状态的Aβ1-40 [2] 。
3. 动物模型的制作：大鼠经10%水合氯醛腹腔麻醉(0.4 g/kg体重)后，固定于江湾1型C大鼠立体定向仪(上海第二军医大学)上，常规备皮消毒，切开皮肤，参照包新明等的《大鼠脑立体定向图谱》，选择右侧海马CA1 区为注射靶区，于前囟向后3.0mm，右侧旁开2.2 mm处，用牙科钻钻开颅骨，暴露硬脑膜，微量注射器自脑表面垂直进针2.8mm，将Aβ1-40 溶液缓慢注入，留针5 min后退出，缝合切口，常规饲养。生理盐水对照组注入等体积生理盐水，假手术组不注射任何溶液。7d后行免疫组化检测。
4. 病理检测：IL-1β和S100 β一抗均购自Sigma公司，SABC试剂盒、DAB由武汉BOSTER公司提供。各组大鼠经深麻醉(10%水合氯醛0.5g/kg)，10%中性缓冲甲醛透心灌注，断头取脑，于前囟后2.5～3.5 mm之间取材，上述固定液后固定12h，常规石蜡包埋，选取注射区附近连续切片16张，片厚5 μm，分4组(每组各4张)，分别进行:(1)HE染色；(2)刚果红染色；(3)IL-1β免疫组化染色；(4)S100 β免疫组化染色。免疫组化采用卵白素-生物素-过氧化物酶复合物(ABC)法进行：3%H2 O2 处理后，S100 β经胰酶消化，IL-1β予微波抗原修复；正常血清封闭后，依次滴加一抗4℃过夜，二抗室温下孵育20min，SABC室温反应20 min，二氨基联苯胺呈色，脱水透明，中性树胶封固。0.01mol/L磷酸盐缓冲液代替一抗作阴性对照。
5. 统计方法：每只大鼠IL-1 β、S100 β各4张切片，在光镜下分别随机选取右侧海马CA1 区内4个视野(×400)，计数IL-1β及S100β阳性细胞数，算出每个视野的均数及标准差，采用方差分析及多重比较进行显著性检验；对48只大鼠海马CA1 区IL-1β和S100 β阳性细胞数分别按相差10个和5个细胞各分为7个等级，进行Spearman等级相关分析，差异有显著意义(P<0.05)。
结果
1.各组大鼠术后24 h精神状态均呈现萎靡，但假手术组和生理盐水对照组大鼠迅速恢复，于第3天饮食和活动与术前无异。而实验组大鼠呈缓慢好转，至第7天取材时行动仍较迟缓，对外界刺激反应迟钝；改变食物和饮水位置时，搜寻时间延长，大剂量组变化尤为明显。
2. HE染色：光镜下各Aβ组注射针道附近细胞增生、聚集，核小深染，呈扁圆形或三角形，胞质少，根据形态上判断为小胶质细胞；稍向外周见核稍大，染色较浅呈卵圆形者为反应性星形胶质细胞。CA1 区锥体神经细胞带不完整，神经元丧失，为胶质细胞所取代(图1)；生理盐水对照组针道附近少量胶质细胞增生，CA1 区受损细胞带明显较窄(图2)；假手术组CA1 区细胞带完整，胶质细胞呈散在分布。
3. 刚果红染色：各Aβ组见棕红色淀粉样蛋白聚集在CA1 区并向周围扩散，苏木素复染示Aβ聚集区及其周围神经元损伤丢失，并为大量增生的胶质细胞所包绕；与AD中的老年斑构成相似(图3)。生理盐水对照组刚果红染色阴性。
4. 免疫组化染色：IL-1β阳性细胞胞体小，呈卵圆形、梭形或三角形，胞浆浓染，突起较少，大多为小胶质细胞(图4)；S100β阳性细胞胞体稍大，卵圆形，突起较多呈放射状，深入周围神经毡中，从形态上判断均为星形胶质细胞(图5)。在海马CA1 区IL-1β及S100 β阳性细胞密集程度随Aβ的注射剂量增加而增大(表1)；生理盐水对照组和假手术组海马各区均有散在分布的IL-1β和S100 β阳性细胞(图6)，但在CA1 区其密度明显低于4 μg/μl以上Aβ剂量组(P均<0.05)，染色亦较浅。对上述两指标的等级相关分析得出等级相关系数(rs )为0.892，P<0.001，提示S100β与IL-1 β的表达呈显著正相关。
表1 海马CA1 区IL-1β及S100 β阳性细胞数(个/视野)
的变化(
±s，n=8)
| 组别 | IL-1 β | S100 β |
| 假手术组 | 17.53±1.87 | 32.12±3.03 |
| 生理盐水组 | 21.16±2.92 | 34.50±3.57 |
| Aβ组 | ||
| 1 μg/μl | 25.33±3.34 | 36.16±3.63 |
| 4 μg/μl | 41.75±2.61* | 42.39±3.46* |
| 7 μg/μl | 56.27±4.16* | 53.57±3.01* |
| 10 μg/μl | 72.53±5.01* | 60.16±4.62* |
讨论
在脑的生理功能和病理反应研究中，常常需要脑内直接给药，脑室注射是目前常用的方法，但其最大的缺陷是药物作用范围广，定位性差且操作复杂，选用海马定位给药是较为理想的途径，而海马CA1 区又与海马内部及海马外结构有广泛的纤维联络，是长时程增强(LTP)形成及学习记忆的重要部位[3] 。本实验选择海马CA1 区进行Aβ微量注射建立局部病理模型，简便易行，且针对性强。HE和刚果红染色初步表明Aβ周围存在较强的炎症反应及神经元丢失。
目前，Aβ的神经毒性机制存在很大争议，原因之一是相关结论大多来自体外实验。近年来，β-淀粉样前体蛋白(β-APP)转基因小鼠模型的研究结果提示，Aβ可能通过持续激活炎症修复机制，将正常情况下的急性反应转变为慢性的炎症损伤。小胶质细胞膜上有Aβ和载脂蛋白E(ApoE)受体，沉积在神经元周围的Aβ，作用于Aβ受体，或通过与ApoE结合后作用于ApoE受体，使小胶质细胞活化、增殖，并过量分泌细胞因子，介导炎症损伤。其中IL-1过度表达和释放是始动环节，IL-1除上调小胶质细胞和星形胶质细胞表达细胞因子，如IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、γ-干扰素(IFN-γ)等之外，尚诱导补体、粘附分子、急性期蛋白、氧自由基、前列腺素、一氧化氮、S100β、β-APP等生成增加[4,5] ，这些分子各自通过作用于胶质细胞或神经元，促进其他炎性分子的产生，这种交互作用，促成了慢性炎症反应的形成和炎性产物水平的持续升高，而多种高水平炎性产物分别在AD病理损伤的不同阶段起作用，并贯穿其病理发展的全过程。
生理状态下，S100β在神经元发育和轴突生长中发挥重要作用。然而，近年来临床病理分析却发现S100β随年龄增长而呈上升趋势，AD病人的S100β含量远高于正常老年组，在部分病灶其活性升高10～20倍，且与老年斑的数量和分布密切相关[6] 。随后Reeves等[7] 的实验证实了高浓度S100β对神经元具有毒性作用，并在S100b(含两个β亚单位)转基因小鼠中复制出类似AD的病理变化。资料表明高浓度S100β的毒性作用主要表现在两个方面：一是升高神经元内钙离子浓度，引起胞内钙超载，诱导tau蛋白磷酸化和神经元凋亡或坏死，而神经元死亡又可引发小胶质细胞活化和IL-1的分泌，形成一个正反馈环路[8] ；二是诱发轴突过量地、无意义地生长，演变为结构不完整的变性轴突，围绕Aβ内核形成老年斑[7] 。近年来的研究显示，S100β尚能刺激神经元过度表达β-APP，增加Aβ的来源，参与老年斑核心的形成[9] ，并构成级联放大效应。
在脑内，S100β主要来源于星形胶质细胞，其分泌量受多种因素调节，其中细胞因子参与了主要的调控机制。AD基础研究发现IL-1α或IL-1β能显著上调S100 β和β-APP的表达水平，并促成由Aβ弥散沉积形成的扩散斑演变为老年斑[10] 。本实验通过观察Aβ对IL-1β和S100β表达的剂量效应及后两者之间的相关分析，进一步揭示了三者之间的密切关系及其在AD炎症机制中的重要作用。
与Aβ相关的分子机制研究正方兴未艾，我们通过在体实验，较好地模拟出AD局部的基本病理改变，Aβ诱导胶质细胞增生、活化及IL-1β、S100 β高表达现象，表明一定剂量的Aβ可诱导类似AD的炎症反应。而Aβ与炎症反应程度的量效关系，提示这种病理现象可能与海马神经元进行性缺失和学习记忆能力减退有关。其具体机制尚待进一步探讨。
图1 Aβ1-40 组CA1 区锥体细胞带受损严重HE×100
图2 生理盐水组CA1 区锥体细胞带受损轻HE×100
图3 Aβ1-40 聚集于CA1 区周边胶质细胞增生刚果红染色×100
图4 Aβ1-40 (10μg/μl组)CA1 区IL-1β表达免疫组化×200
图5 Aβ1-40 组CA1 区S100β的表达免疫组化×200
图6 生理盐水组CA1 区S100β的表达 免疫组化×200
参考文献
1，Cotman CW,Tenner AJ, Cummings BJ. β-amyloid converts an acute phase injury response to chronicinjury responses. Neurobiol Aging, 1996,17:723-731.
2，Giovannelli L, Casamenti F, Scall C, et al. Differential effects of amyloidpeptides β-(1-40) and β-(25-35) injection into the rat nucleus basalis. Neuroscience,1995,66:781-792.
3，罗焕敏. 海马结构——从形态、功能到可塑性、衰老性变化.神经解剖学杂志, 1996,12:177-184.
4，McGeer PL, McGeer EG. The inflammatory response system of brain: implication fortherapy of Alzheimer and other neurodegenerative disease. Brain Res Rev, 1995,21:195-218.
5，Prasad KN, La Rosa FG, Prasad JE. Prostaglandins act as neurotoxin fordifferentiated neuroblastoma cells in culture and increase levels of ubiquitin and β-amyloid.In Vitro Cell Dev Biol Anim， 1998,34:265-274.
6，Goodison KL, Parhad IM, White CL, et al. Neuronal and glial gene expression inneocortex of Down′s syndrome and Alzheimer′s disease. J Neuropathol Exp Neurol,1993,52:192-198.
7，Reeves RH, Yao JB, Crowley MR, et al. Astrocytosis and axonal proliferation in thehippocampus of S100b transgenic mice. Proc Natl Acad Sci USA, 1994,91:5359-5363.
8，Mrak RE, Sheng JG, Griffin WS. Glial cytokines in Alzheimer′s disease: review andpathogenic implications. Hum Pathol, 1995,26:816-823.
9，Li Y, Wang J, Sheng JG, et al. S100 beta increases levels of beta-amyloid precursorprotein and its encoding mRNA in rat neuronal cultures. J Neurochem, 1998,71:1421-1428.
10，Sheng JG, Ito K, Skinner RD, et al. In vivo and in vitro evidence supporting arole for the inflammatory cytokine interleukin-1 as a driving force in Alzheimerpathogenesis. Neurobiol Aging, 1996,17:761-766.
(收稿日期： 1999-10-09 ) , 百拇医药