关键词：血小板活化因子；钙；神经元
【摘要 】 目的 观察脑损害时病理活性介质血小板活化因子(plateletactivating factor, PAF)及其拮抗剂对神经细胞内游离钙离子([Ca2+ ]i)浓度的影响，探讨PAF致使神经细胞内[Ca2+ ]i超载的途径及其作用机制。方法 采用AR-CM-MIC阳离子检测系统，观察不同浓度的PAF以及其特异性受体拮抗剂BN52021和非特异性拮抗剂MK-801对体外培养14天的大鼠皮层神经元[Ca2+ ]i浓度的影响。结果 5×10-6 mol/L的PAF可使培养神经细胞[Ca2+ ]i浓度明显增高，与对照组比较差异有显著意义(P<0.01)；BN52021可明显阻止PAF所致的神经细胞内[Ca2+ ]i超载，在此基础上加用MK-801可使神经细胞内[Ca2+ ]i水平下降的更为明显。结论 PAF可通过多种渠道致使神经细胞内钙离子超载。
The effect ofplatelet activating factors on cytosolic free calcium of cultured neurons from cerebralcortex in rats WANG Wei , XU Jianhua. Department of Neurology,Tongji Hospital,Tongji Medical UniversityWuhan 430030
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【 Abstract 】 Objectives To determine the effect ofplatelet activating factor (PAF) on cytosolic free calcium ( [ Ca2+ ] i) of cultured neurons from cerebral cortex in rats andtheir pathepenetic effect on neuronal calcium overload and ceubal brain. Methods The primary neuron cultured for14 days was obtained and the effect of PAF in different concentrations on [ Ca2+ ] i was observed by the AR-CM-MICcation measurement system .The route of PAF increase [ Ca2+ ] i was observed with BN52021 and MK-801. Results The [ Ca2+ ] i was elevated by PAF in the concentration of 5×10-6 mol/L (P<0.01), but the effect was blocked by the specific PAF receptor antagonistBN52021. The effect of BN52021 was strengthened by MK-801. Conclusion [ Ca2+ ] i of the cultured neurons iselevated by PAF. PAF receptor antagonist BN52021 and MK-801 have a potent resistant effecton PAF.
【 Keywords 】 Plateletactivating factor Calcium Neurons
细胞内外钙离子的稳态失调是缺血性神经元损伤及坏死的主要机制之一，而PAF是一种与花生四烯酸代谢密切相关的内源性活性磷脂及脂质介质。大量研究结果表明，脑缺血过程中神经细胞内钙离子超载和PAF积聚是脑损害各个病理环节中的“扳机点”，二者共同介导并直接参与了缺血及再灌注期脑组织的损害；低浓度的PAF则可影响神经细胞钙离子的流动，使神经细胞游离钙离子([Ca2+ ]i)浓度水平明显增高[1-3] 。但迄今为止，PAF促使神经细胞内钙离子超载的途径及机制尚不十分清楚。为此，我们采用AR-CM-MIC阳离子检测系统，观察不同浓度的PAF对体外培养大鼠皮质神经元[Ca2+ ]i浓度的影响，并同时观察了PAF特异性受体拮抗剂BN52021以及MK-801对PAF所致神经元钙离子超载的作用，探讨PAF致使神经元钙离子超载的途径及其在脑损害时的作用机制。
材料与方法
一、 材料
PAF、Fura2-AM (Sigma公司)，BN52021(法国Braguet博士惠赠)，MK-801(重庆医科大学药理教研室)，AR-CM-MIC阳离子测定系统(美国Spex公司)，Diapho-TMD型荧光倒置显微镜(日本Nikon公司)。
二、 方法
1.神经细胞培养：取孕18日SD大鼠，断头后无菌取脑并去除脑膜，无菌Hank液冲洗后，分离大脑皮层并将其放入试管中，充分吹打至看不见组织块为止，静置5分钟。将上清液移入10ml离心管中，100×g离心5分钟，去除上清，置于完全培养基(DMEM/F12 85%，胎牛血清5%，小牛血清10%)，混匀。以5×106 个细胞/L接种于25 ml培养瓶中，37℃ ，50分钟。抽取未贴壁的细胞，以5×105 个细胞/L接种于放置有小玻片(已涂有多聚赖氨酸)的12孔培养板中，37℃，5%CO2 条件进行培养，定期换液至第14天，可见典型的锥体样神经细胞，取出小玻片用Hank液清洗2次后待用。
2.单细胞胞浆[Ca2+ ]i浓度测定：3 μmol/L Fura-2/AM孵育小玻片，37℃，40分钟，中间轻轻振摇1次，小玻片经无镁Hank液漂洗2次，放入含有1ml无镁Hank液的特制瓶中，在阳离子测定系统中检测单个锥体样神经元的荧光强度，激发光波长分别为340nm和380 nm，发射光波长为505 nm，观察不同实验条件下荧光强度的变化。通过玻璃微量移液器加入条件液，在1秒钟内完成加样过程，由下式计算胞浆内[Ca2+ ]i[1] ：[Ca2+ ]i =Kd*β*(R-Rmin)/(Rmax-R)。式中R是实测率，Rmin是最小率，Rmax是最大率，Kd是Fura-2与钙离子结合的解离常数，β是F380 最小/F380 最大的比值。神经元的自发荧光在没有负载Fura-2时进行测定，计算钙离子浓度前减去自发荧光和背景荧光。
3.实验分组：(1)PAF组： 通过玻璃微量移液器分别将5×10-6 mol/L、5×10-5 mol/L的PAF加入被测细胞周围孵育液中，1秒钟内完成；(2)BN52021组：在加入5×10-5 mol/L PAF之前，将20 μg BN52021加入细胞孵育液中，然后将PAF(5×10-5 mol/L)加入到被测细胞周围孵育液中；(3)联合治疗组(BM)：在加入PAF之前将BN5202120 μg及MK-801 40 μg 同时加入到细胞孵育液中，然后再将PAF(5×10-5 mol/L)加入到被测细胞周围孵育液中。
结果
神经细胞基础[Ca2+ ]i浓度为(0.994～1.034)×10-7 mol/L。5×10-6 mol/L PAF组神经细胞[Ca2+ ]i水平较对照组有所增加，5×10-5 mol/L PAF组神经细胞[Ca2+ ]i水平较对照组增加更为明显(P<0.01)。BN52021组神经细胞[Ca2+ ]i水平较5×10-5 mol/L PAF组有所下降，而BN52021联合MK-801治疗组神经细胞[Ca2+ ]i水平较5×10-5 mol/LPAF组下降的更为显著(P<0.01)。见表1。
表1 血小板活化因子及其拮抗剂对培养神经元
细胞内游离钙离子浓度的影响(
±s)
| 组别 | 例数 | 神经细胞内[Ca2+ ]i (1×10-7 mol/L) |
| 对照组 | 18 | 0.99±0.15 |
| PAF 1×10-6 mol/L组 | 7 | 1.38±0.19* |
| PAF 1×10-5 mol/L组 | 10 | 2.04±0.18*△ |
| PAF+BN 52021组 | 7 | 1.16±0.13** |
| PAF+BM组 | 7 | 1.05±0.12** |
*与对照组比较，P<0.01;△ 与PAF 1×10-6 mol/L组比较，P<0.01;** 与PAF 1×10-5 mol/L组比较，P<0.01
讨论
PAF为缺血半暗带区主要的病理介质[4] ,其不仅对神经组织有直接的毒性作用，更为重要的是其在脑缺血继发性脑损害过程中增强、活化了一系列与损害有关的介质和关键的病理环节。Kochanek等[5] 用生光钙探针-水母发光蛋白研究PAF对细胞钙离子内流的影响，发现极低浓度的PAF则可影响神经细胞钙离子的流动，致使神经细胞内[Ca2+ ]i浓度明显增加。本研究结果证实了该结论，并发现5×10-6 mol/LPAF可使神经细胞内[Ca2+ ]i水平明显增高。随着PAF浓度的增加，神经细胞内[Ca2+ ]i水平逐渐提高。当PAF的浓度达到5×10-4 mol/L 时，培养神经元立即皱缩、死亡。可见PAF对神经元本身有直接的毒性作用。大量研究结果已经证实，脑缺血时PAF可通过与之特异受体相偶联的G蛋白结合，激活GTPase及磷脂酰肌醇(phosphatidylinostiol,PI)特异的磷脂酶C(PLC)，从而促进磷脂肌醇代谢增强,使二酰基甘油(diacylglycerol，DG)及三磷酸肌醇(inositoltrisphosphate，IP3 )水平增高，最终引起细胞内储存钙离子增加、蛋白激酶C活化，从而使膜结构改变，离子通道受损及跨膜信息传递紊乱[3,6,7] 。本研究结果显示，特异性PAF受体拮抗剂BN52021可有效地阻止PAF所致的神经细胞内钙离子超载，也为以上理论提供了佐证。
现已明确，PAF可通过激活IP3 致使神经元胞内钙库中储存的钙离子释放增加。但PAF是否可直接通过细胞膜上的受体操纵型或电压敏感型钙离子通道，使细胞外大量的钙离子内流，目前尚不十分清楚。我们在用特异性PAF受体拮抗剂BN52021的同时加用了非特异性的NMDA受体拮抗剂MK-801,结果更为有效地阻断了PAF所致的神经细胞内钙离子超载现象。该结果说明，PAF可直接影响细胞膜上的受体操纵型钙离子通道，增加神经细胞内[Ca2+ ]i浓度。由此可见，PAF作为一种病理活性介质，可通过多种渠道致使神经元胞内钙离子超载。因此，脑缺血的脑保护治疗措施应强调针对各个病理环节的综合治疗。
本课题为国家自然科学基金重点资助项目(No.39870260)
参考文献
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(收稿：1998-07-13 修回：1998-12-25) , 百拇医药