关键词：
长期以来，缺乏直接尿液卵泡刺激素(FSH)测定方法，因尿液中的FSH在尿样反复冻融过程中容易解离。Qiu等[1] 首创了尿样FSH测定的酶免疫法。我们利用本室制备的FSHβ亚单位多克隆抗体，验证了这种方法的可行性。
一、材料和方法
1.试剂：β人FSH单克隆抗体，为Scantibodies实验室产品；β人FSH多克隆抗体兔抗血清，由本实验室制备；生物素标记多克隆羊抗兔IgG，为Bio-Rad公司产品；FSHβ亚单位标准品，由美国激素与垂体学会(NHPP)提供。
2.样本收集：正常育龄妇女7名，共收集9个正常月经周期的每日晨尿，同时收集25份不同个体的血样。另1名正常妇女自愿收集每日的尿样和血样。分别用本试验方法测定尿液中的FSH，放射免疫法测定血清中的FSH。所有样品均在-20℃冰箱保存。测定前待尿样融化后煮沸2分钟。
3.方法：(1)尿液FSH酶免疫法：Nunc-Immuno板各孔加入10 μg/ml的β人FSH单抗200μl，室温下孵育6小时或过夜。除去剩余液体，拍干，每孔加含10 g/L酪蛋白的磷酸盐缓冲液(PBS)进行阻断。除去阻断剂，洗板，各孔加入含小牛血清白蛋白(BSA)的0.5mol/L PBS 50 μl。150 μl加热处理的尿样、倍比稀释的FSHβ亚单位标准及内控分别加入相应各孔内，室温下孵育6小时或过夜。洗板后每孔加200 μl 1∶10 000倍稀释的多克隆抗-β人FSH兔抗血清，室温下孵育6小时或过夜。洗板，再以生物素标记的多克隆羊抗兔IgG(1∶6400)稀释后，每孔加 200 μl，室温下孵育2小时。洗板后每孔加200 μl(1∶2000)稀释的碱性磷酸酶(APS)，室温孵育1小时。洗板4次，加入1 mg/mlP-对硝基酚磷酸200 μl/孔。读板的同时用碱性苦味酸法测定尿肌酐。(2)血清FSH的测定：用传统放射免疫法。
二、结果
1.标准曲线及线性分析：以β FSH标准的浓度为横坐标，所测得的相应吸光度对数值为纵坐标，得出剂量-反应标准曲线。将正常育龄妇女卵泡期和黄体期、正常男性及绝经期妇女尿样各1份作倍比稀释，测定其吸光度(A)值，做剂量-反应曲线。结果显示标准曲线和上述尿样稀释曲线基本平行。
2.灵敏度和精密度：本方法的灵敏度为0.18 ng/ml。低浓度和高浓度内控板内的CV分别为4.48%和4.42%。板间CV分别为7.18%和3.12%。
3.回收率：16、8、4、2、1和0.5 ng/ml β FSH标准回收率分别为103.6%、95.5%、88.5%、108.1%、94.0%和88.5%。
4.尿液与血清FSH的相关性：将25份尿液和血清中的FSH作直线相关分析，r=0.69,P<0.001，二者呈高度相关。1名妇女1个月经周期中的尿FSH与血清FSH的周期性变化基本一致。
5.正常女性月经周期中尿液FSH的变化情况：卵泡早期、卵泡晚期、FSH峰、黄体早期及黄体晚期尿液FSH水平依次为：(4.5±2.0)、(2.9±1.3)、(13.0±5.2)、(1.8±0.9)和(2.1±1.3) ng/mg肌酐。肌酐校正前后尿液FSH值呈高度相关(r=0.95,P<0.001)。但其CV差异有非常显著意义(t=5.60P<0.01)。说明尿液FSH值用肌酐校正后可以减少个体差异。
四、讨论
血清FSH作为女性生殖功能评价的生物标记物，存在一定的局限性。而尿液FSH的应用相对具有以下优点：首先，晨尿中的FSH经过肾脏的浓缩，其浓度基本反映了体内FSH的平均水平，大大减少了FSH脉冲性分泌对测定结果的影响。尿液中FSH的量用肌酐校正后，消除了个体间因肾功能及饮水量不同对测定结果的影响，增强了样本间的可比性。其次，与血样的收集相比，尿样具有自我收集、无损伤性的优点。
但尿液中的FSH不象血液中那样稳定。研究表明，在反复冻融的尿样中，完整的FSH的量是降低的，FSHβ亚单位的水平则显著升高。所以在反复冻融的尿液中，完整FSH的量不能反映尿液中FSH的真实水平。酶免疫法可将FSH完全解离为亚单位，通过测定尿液中的β亚单位来反映完整FSH的浓度，成功地解决这一问题。
我们用自制的多克隆β人-FSH兔抗血清作为第二抗体，将尿样煮沸2分钟，使尿液中FSH二聚体完全解离为亚单位。实践证明这是一种简单经济的尿样处理方法，其最低检测限值可达0.18 ng/ml，灵敏度有所提高，且具有较高的回收率和重复性。我们的研究进一步证明了血清FSH与尿液FSH的相关性。今后将逐步建立月经周期各期的正常值范围。同时由于尿液的收集较为方便，可通过连续收集女性一个或几个月经周期的尿样，观察FSH在月经周期中的变化情况，对女性生殖功能作出更为全面可靠的评价。
参考文献
1 Qiu Q, Kuo A, Todd H, et al. Enzyme immunoassay method for urinaryfollicle stimulating hormone (FSH) β subunit and its application for measurement fortotal urinary FSH. Fertil Steroid, 1998, 69:278-285.
(收稿：1998-07-14 修回：1998-10-05)
, http://www.100md.com