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关键词：癫痫；GABA；色谱法，高压液相；谷氨酸脱羧酶
【摘要 】 目的 探索癫痫发生与γ-氨基丁酸(GABA)浓度、谷氨酸脱羧酶(GAD)活性的关系。方法 采用印防己毒(PTX)腹腔注射制做SD鼠慢性点燃模型，并将其分为对照组、癫痫发作组、发作间期组和苯巴比妥钠干预组。用高效液相色谱仪(HPLC)测定颞区脑组织GABA浓度和GAD活性。结果 注药第20 d，71%的鼠达到完全点燃状态；癫痫发作组鼠颞区脑组织GABA浓度为(3.82±0.81) μmol/g，GAD活性为(11.85±2.56) μmol/g，较对照组〔(2.15±0.37)μmol/g,(7.69±2.12)μmol/g〕明显增高；癫痫发作间期组鼠颞区脑组织GABA浓度为(3.27±1.42)μmol/g，GAD活性为(8.91±2.44) μmol/g，较发作期〔(3.82±0.81)μmol/g，(11.85±2.56)μmol/g〕有所下降，但高于对照组。苯巴比妥钠干预组鼠颞区脑组织GABA浓度〔(2.36±0.61)μmol/g〕、GAD活性〔(6.96±2.58)μmol/g〕无明显变化。结论 在该模型中，GABA浓度、GAD活性与癫痫发作密切相关，提示GABA能神经元的抑制功能增强是机体重要的内源性抗癫痫机制。用苯巴比妥钠和PTX同时腹腔注射，可以预防癫痫的发生。
Relationshipbetween the epileptic seizure and both the GABA concentration, and GAD activity intemporal tissue
TIANFafa, XIE Guangjie, YANG Qidong, et al.
Department of Neurology,Xiangya Hospital, Hunan Medical University, Changsha 410008, China
【 Abstract 】 Objective To study the relationship betweenepileptic seizure and the concentration of γ -aminobytyric acid (GABA), and the activity of glutamatedecarboxylase (GAD). Methods High-performance liquid chromatography (HPLC) was used todetermine the GABA content and the activity of GAD in the temporal tissue ofSprague-Dawley(SD) rats; SD rats were devided randomly into four groups: control group(Group A), epilepsy group in ictal period (Group B), epilepsy group in interictal period(Group C) and the phenobarbital group (Group D). The kindling model of rats was induced bydaily injection of picrotoxin (PTX) intraperitoneally. Results The average value of temporalGABA content (3.82±0.81 μ mol/mg) and GAD activity (11.85±2.56 μ mol/mg) in Group B was much higher than that in Group A(P<0.05). In comparison with Group B, the temporal GABA content (3.27±1.42 μ mol/mg) and GAD activity (8.91±2.44 μ mol/mg) in Group Cwere decreased, but higher than that in Group A. The results of GABA content and GADactivity between Group A and Group D revealed no significant difference. Conclusion s The changes of GABA and GAD wereclosely related to the epileptic seizure. The results suggest that the augmented GABAergicneurotransmission is the selfprotective and anticonvulsive mechanism in this model.Phenobarbital sodium can protect it from seizure provided that the SD rats were givendaily injection of PTX intraperitoneally.
【 Keywords 】 Epilepsy ； GABA ； Chromatography, high pressure liquid; Glutamate decarboxylase
癫痫是神经内科的常见病，严重影响患者的工作能力和生活质量。癫痫发作是由于大脑神经元异常放电所致，其发生机制仍不十分清楚。有关γ-氨基丁酸(GABA)浓度和谷氨酸脱羧酶(GAD)活性在癫痫中变化的报道存在矛盾，这些变化是癫痫发生的原因或结果不能肯定。我们采用印防己毒(PTX)腹腔注射，制做SD鼠癫痫点燃模型，通过检测癫痫发作期和间歇期脑组织GABA浓度和GAD活性来探讨其与癫痫发生的关系，并用药物干预癫痫的发作来探讨药物对上述指标的影响。
材料与方法
1. 实验动物： 健康SD鼠(由湖南医科大学实验动物中心提供)28只，6～8周龄，体重140～180g，雌雄各半，随机分为：(1) 对照组(A组,8只)：腹腔注射生理盐水；(2)癫痫发作组(B组,8只)：腹腔注射PTX 1.5 mg*kg-1 *d-1 ，连续用20～28d；(3) 癫痫发作间期组(C组,6只)：模型制做成功后，停用PTX 1周后采取标本；(4)：药物干预组(D组，6只)：每次在腹腔注射PTX前，腹腔注射苯巴比妥钠50mg*kg-1 *d-1 ，连续用20～28 d。
2. SD鼠癫痫模型的建立：按Shandra等[1] 方法进行，每天上午8：30～10：00腹腔注射PTX，连续20～28 d。癫痫发作的分级标准参照Racine[2] 的方法。
3. 脑组织标本采集： 用2%戊巴比妥腹腔注射(40 mg/kg)麻醉后，按住动物于器械盘中，剪开头皮及颅骨，剥去头顶骨，用高温消毒的剪刀将整个脑组织拿出，用滤纸吸去血液，在干净的器皿中快速剪下颞区脑组织，放入冻存管，立即将冻存管置液氮中，放在-70℃冰箱内保存备用。
4. 脑组织匀浆制备：取脑组织在电子天平上称重，按1∶10(W∶V)加入预冷的脑组织匀浆液，在超声匀浆器中破碎(15s×3)，在4℃低温离心机中15 000×g离心20 min，取上清液，置-20℃冰箱保存，3d内进行GABA浓度和GAD活性检测。
5. 脑组织GABA浓度测定： 按Chen等[3] 建立的高效液相色谱法进行检测。计算方法：外标法以峰面积定量。公式如下：
GABA浓度=(A样/A标)×标准品浓度×标准品取样量×样品总体积/样品取样量×样品重量，单位：μmol/g
6. GAD活性测定：酶反应条件按Wolf等[4] 建立的方法进行。计算方法：将同一样品GAD反应后的GABA浓度减去反应前GABA浓度，就是每克脑组织所含GAD的活性，即每克脑组织在20min内反应所生成的GABA的量(μmol/g)。
7. 统计学处理：测定数值用平均值±标准差(±s)表示。多组样本均数间比较先用方差分析，再用q检验。如果方差不齐，先进行变量转换使方差变齐，再进行上述分析。所有数据运用SPSS统计软件包在计算机上进行分析。
结果
一、癫痫模型的观察
1.发作情况：A组无癫痫发作；B组2只为Ⅲ级发作，5只为Ⅳ级发作，1只为Ⅴ级发作；C组均达到完全点燃后(2只Ⅲ级发作，4只Ⅳ级发作)，停止注射PTX1周；D组1只为Ⅱ级发作,其余无癫痫发作。
2.脑电图记录：在鼠完全点燃后进行脑电图记录。用橡皮套套住鼠的4只脚，固定在木板上，再用细麻绳套住鼠牙以固定头部。用2根电极，1根插入顶部头皮下，1根插入同侧耳后皮下，在日本光电5210型10导脑电图机上描记脑电活动。可见点燃鼠脑电图上出现典型尖波和棘波发放。用同样方法记录正常对照组，未见癫痫样放电波。
二、脑组织GABA浓度和GAD活性的变化
颞区脑组织匀浆经预处理后，用高效液相色谱OPA柱前衍生法测定脑组织GABA浓度和GAD活性，计算结果见表1。
表1 各组颞区脑组织GABA浓度和
GAD活性(±s，μmol/g)
| 组别 | γ-氨基丁酸 | 谷氨酸脱羧酶 |
| 对照组 | 2.15±0.37 | 7.69±2.12 |
| 癫痫发作组 | 3.82±0.81* | 11.85±2.56* |
| 癫痫发作间期组 | 3.27±1.42 | 8.91±2.44 |
| 药物干预组 | 2.36±0.61 | 6.96±2.58 |
癫痫发作组鼠颞区脑组织GABA浓度和GAD活性较对照组增高，差异有显著意义(P<0.05)；癫痫发作间期组鼠颞区脑组织GABA浓度和GAD活性较发作期有所下降，仍高于对照组，与对照组、癫痫发作组比较无显著差异。苯巴比妥钠干预组鼠颞区脑组织GABA浓度、GAD活性与对照组比较无显著差异。
讨论
一、PTX点燃癫痫模型
我们采用PTX腹腔注射1.5 mg*kg-1 *d-1 ，每天上午进行。第8次注药后开始出现惊厥发作，而Shandra等在第3～5次注药后大鼠开始惊厥发作，这可能与鼠种、体重和个体差异等有关。当注射20d时，有71%的鼠达到完全点燃状态，与文献报道相似。没有完全点燃的鼠，适当增加注射次数，至完全点燃为止，以便进一步研究。
PTX腹腔注射点燃癫痫动物模型属慢性继发性全身发作性癫痫模型，本模型具有以下特点：(1)制作方便，成功率高；(2)不受麻醉剂和手术过程的影响，便于全面观察动物惊厥发作；(3)所需仪器设备简单，容易推广；(4)不破坏局部脑组织的结构，有利于进一步开展脑组织各项指标的检测。该模型的主要缺点：(1)诱导过程较长，一般需要2～3周；(2)缺乏明确的病灶，与人类继发性全身发作性癫痫有一定的差别。
在每次腹腔注射PTX之前，注射苯巴比妥钠(50 mg/kg)，可以阻止癫痫的发生。本研究中6只鼠中只有1只出现Ⅱ级发作。可见，苯巴比妥钠可以有效地预防PTX致慢性点燃癫痫模型的形成。
二、颞区脑组织GABA浓度、GAD活性与癫痫发生的关系
我们发现，PTX腹腔注射致鼠点燃模型中，在癫痫发作期颞区脑组织GABA浓度明显增高，发作间期有所下降，但仍高于对照组。脑组织GABA浓度增高，其作用于突触后膜GABAA 受体，使抑制性突触后电位增强，起到抑制神经元异常放电的作用。这种改变可能是脑组织对神经元异常放电的反应，随着神经元兴奋性的变化而不同。颞区海马是边缘系统的一个重要组成部分，具有广泛的纤维联系。Liebowitz等[5] 在电剌激所致的SD鼠点燃模型中发现，海马神经元释放GABA明显增高。Ding等[6] 在海人酸诱导的模型中发现，海马CA1 、CA3 区细胞外液中GABA水平增加，同时CA3 区苔状纤维GABA免疫活性增强。Ribak等[7] 发现，遗传性癫痫大鼠颞叶皮质中GABA浓度明显增高。Peterson等[8] 发现，癫痫敏感性沙土鼠海马GABA能神经元和末梢的数量增加。这些结果表明，癫痫发作过程中GABA能神经元功能增强，与本实验结果相符合。
GAD是GABA合成的限速酶，直接影响脑组织中GABA的浓度。另一方面，GAD在脑组织中的分布与GABA能神经元基本一致，被视为GABA能神经元的直接标志物，而且在脑组织标本中比GABA更稳定。因此，常通过测定脑组织GAD活性或GAD阳性神经元的数量、形态来反映中枢神经系统GABA能神经元的功能状态[9] 。
我们通过HPLC测定PTX腹腔注射致点燃癫痫模型中颞区脑组织GAD活性发现，癫痫发作期GAD活性明显增高，发作间期有所下降，但仍高于对照组。结合脑组织GABA浓度的变化，我们认为，上述改变是癫痫过程中兴奋性增强，引起GABA能神经元抑制功能代偿性增加的结果。
本研究结果显示，GABA改变和GAD活性变化一致，颞区脑组织GABA浓度升高是由于GAD活性增强所致，可能是癫痫发作后GABA能神经元介入的抑制功能代偿性增加的结果，为机体内源性抗癫痫机制增强的一种反应。Marksteiner等[10] 在海人酸和戊四氮诱导的SD鼠癫痫模型中，用荧光检测方法发现，前脑皮层GAD活性明显增高，且持时间较长(1个月)；在临床检测方面，侯国庆等[11] 收集未进行抗癫痫药物治疗的、24h内未发作的癫痫患者的脑脊液，采用酶化学反应结合荧光薄层扫描方法，发现癫痫患者脑脊液中GAD活性明显增强，病程长于3年的患者尤为显著。这些结果和本实验结果一致，亦认为GAD活性增加是机体的一种代偿性反应。而在苯巴比妥钠干预组，颞区脑组织GABA浓度和GAD活性无明显改变，说明用药物预防SD鼠癫痫发作时，没有出现这种代偿性反应。
参考文献
1，Shandra AA,Mazarati AM, Godlevsky LS, et al. Chemical kindling: implications for antiepilepticdrugs-sensitive and resistant epilepsy models. Epilepsia, 1996, 37:269-274.
2，Racine RJ. Modification of seizure activity by electrical stimulation. Ⅱ. Motorseizure. Electroencephalogr Clin Neurophysiol, 1972, 32:281-294.
3，Chen BM, Xia LW, Zhao RQ. Determination of NG , NG -dimethylargininein human plasma by high-performance liquid chromatogphy. J Chromatogr B Biomed Sci Appl,1997, 692:467-471.
4，Wolf R, Klemisch H. Adaptation of an enzymatic fluorescence assay for L-glutamicacid decarboxylase. Anal Biochem, 1991, 192:78-81.
5，Liebowitz NR, Pedley TA, Cutler RWP. Release of γ-aminobutyric acid fromhippocampal slices of the rat following generalized seizures induced by daily electricalstimulation of entorhinal cortex. Brain Res, 1978, 138:369-373.
6，Ding R, Asada H, Obata K. Changes in extracellular glutamate and GABA levels in thehippocampal CA3 and CA1 areas and the induction of glutamic acid decarboxylase-67 indentate granule cells of rats treated with kainic acid. Brain Res, 1998, 800:105-113.
7，Ribak CE, Byun MY, Ruiz GT, et al. Increased levels of amino acid neurotransmittersin the inferior colliculus of the genetically epilepsy-prone rat. Epilepsy Res, 1988, 2:9-13.
8，Peterson GM, Ribak CE, Oertel WH. A regional increase in the number of hippocampalGABAergic neurons and terminals in the seizure-sensitive gerbil. Brain Res, 1985,340:384-389.
9，Houser CR, Harris AB, Vaulghn JE. GAD activity decrease in mouse neocortex afterlesions of the basal forebrain. Brain Res, 1985, 333:165-168.
10，Marksteiner J, Sperk G. Concomitant increase of somatostatin, neuropeptide Y andglutamate decarboxylase in the frontal cortex of rats with decreased seizure threshold.Neuroscience, 1988, 26:379-385.
11，侯国庆, 阮旭中, 沈安华, 等.癫痫患者脑脊液谷氨酸脱羧酶活性的改变. 中国神经精神疾病杂志，1997，23：303.
(收稿日期：
1999-12-21 ) , 百拇医药