¹²⁵I-β-CIT的制备与动物体内分布特性研究

http://www.100md.com 《中华核医学杂志》 2000年第3期

孙文善 刘振国 沈鸣华 钱隽 李培勇 朱承谟 陈生弟 孙文善(上海第二医科大学附属瑞金医院核医学科 200025)；李培勇(上海第二医科大学附属瑞金医院核医学科 200025)；朱承谟(上海第二医科大学附属瑞金医院核医学科 200025)；刘振国(上海第二医科大学附属瑞金医院神经内科 200025)；陈生弟(上海第二医科大学附属瑞金医院神经内科 200025) 中华核医学杂志 2000 0 20 3
关键词：CIT；碘放射性同位素；同位素标记；药代动力学 期刊 zhhyxzz 0 论著 fur -->

【摘要】 目的 评价¹²⁵ I-甲基-3β-(4-碘苯基)托烷-2β-羧酸甲基脂(β-CIT)在体内和脑内的结合特性。方法 应用过氧乙酸标记法和氯胺-T法进行¹²⁵ I-β-CIT标记,并进行动物体内分布特性研究。结果 标记率分别为(53.4±7.9)%和(88.4±3.49)%。小鼠静脉注射¹²⁵ I-β-CIT后,放射性主要浓聚在纹状体等脑区,其峰值摄取出现在药物注射后2h。GBR12909显著抑制纹状体内¹²⁵ I-β-CIT的摄取,而clomipramine则显著抑制大脑皮层和海马内¹²⁵ I-β-CIT的摄取。大鼠整体放射自显影表明,¹²⁵ I-β-CIT主要通过肝胆途径代谢。结论 碘标β-CIT是一种良好的中枢多巴胺转运蛋白显像剂。

The Preparationof ¹²⁵ I-β-CIT and its biological distribution in animal

SUN Wenshan, LIU Zhenguo,SHEN Minghua
(Ruijin Hospital of Shanghai Second Medical University, Shanghai 200025, China)

【Abstract】 Objective To prepare and label the ¹²⁵ I-β-CIT andstudy its biological distribution in animal. Methods ¹²⁵ I-β-CITwas prepared by the peracetic acid method and the chloramine-T method, and dopaminetransporter (DAT) binding properties of ¹²⁵ I-β-CIT were examined by in vivobiodistribution and inhibition studies in mice and whole body autoradiography in rats. Results Theradiolabeling yields of the peracetic acid and the chloramine-T methods were (53.4±7.9)%and (88.4±3.49)%, respectively. Following intravenous injection in mice, ¹²⁵ I-β-CITshowed high accumulation in striatum, time to peak level uptake was 2 h after injection.GBR12909 significantly inhibited ¹²⁵ I-β-CIT binding in striatum, whileclomipramine significantly inhibited ¹²⁵ I-β-CIT binding in hippocampus andcerebral cortex. The rat whole body autoradiography showed that the clearance of thetracer occurred through the hepatobiliary route. Conclusions Theresults indicate β-CIT is an agent suitable for DAT imaging and can be used for the studyof Parkinson's disease.
【Key words】 CIT; Iodine radioisotopes;Isotope labeling; Pharmacokinetics

多巴胺转运蛋白(DAT)在控制多巴胺(DA)能神经传递的过程中发挥着重要作用^[1] 。Parkinsons病(PD)的严重程度与DA能神经终末DAT丧失相平行^[2] ,因此,放射性标记的DAT显像剂可以进行PD的早期诊断。目前,可卡因类衍生物显像剂甲基-3β-(4-碘苯基)托烷-2β-羧酸甲基脂(β-CIT)已广泛用于PD等神经精神紊乱疾病的临床研究^[3] 。我们参照Baldwin等^[4] 的方法,分别用过氧乙酸法和氯胺-T法制备了¹²⁵ I-β-CIT,并对标记物的体内分布与脑内结合特性进行评价,现报道如下。

材料和方法

一、 材料
标记前体trimethylstannyl-β-CT 50 μg,美国RBI公司产品;Na¹²⁵ I溶液,购自Amesharm公司。
二 方法
1. ¹²⁵ I-β-CIT的标记制备与鉴定。过氧乙酸标记方法参照文献[4],在含2μg标记前体的反应瓶内加入5 μL乙醇和50 μL 0.5 mol/L H₃ PO₄ ,投入适量的Na¹²⁵ I,摇匀后注入新鲜配制的100μL 0.32%过氧乙酸,室温下反应15 min,加入100 μL NaHSO₃ 液(100 g/L)终止反应。氯胺-T法方法基本同上,氯化物用4g/L的氯胺-T 50 μL,加入50 μL Na₂ S₂ O₃ 终止反应。标记物采用萃取法进行纯化：反应液中加入1mL饱和NaHCO₃ 溶液,调pH值至中性或偏碱性,用1 mL无水乙醚萃取3次,合并有机相,过无水Na₂ SO₄ 柱,N₂ 吹干,加入适量无水乙醇溶解备用。用薄层层析法和纸层析法测定放化纯度,支持物选用G254硅胶薄层板,展开体系为氯仿∶乙醇∶氨水=9∶1∶0.2。
将标记物与非标记β-CIT同时点于G254硅胶板层析后,用显色剂显色,并分段测定放射性,观察非标记β-CIT的斑点位置与标记物的放射性峰是否一致。然后将所得标记物溶于无水乙醇,加入适量1g/L的抗坏血酸溶液,置4 ℃冰箱保存,每日测定标记物的放化纯度,观察其稳定性。
2. ¹²⁵ I-β-CIT小鼠体内与脑内分布实验。动物用昆明小鼠,雌性,体重18～22g,每组5只,尾静脉注射¹²⁵ I-β-CIT 0.2 mL 74 kBq后,在5 min～12 h等不同时相将各组小鼠断头处死,迅速解剖脑、心等器官组织,脑进一步分离纹状体、大脑皮层、小脑、海马等脑区,称组织湿重后,用γ计数器测组织放射性,计算每克组织放射性占注射剂量的比值(%ID/g)。
3. ¹²⁵ I-β-CIT小鼠脑内结合抑制研究。雌性昆明小鼠15只,体重18～22g,分为3组：生理盐水组、GBR12909组和clomipramine组。各组首先经尾静脉注射0.1mL生理盐水或相应药物(10 mg/kg ),注射5 min后,再向尾静脉内注射0.1 mL¹²⁵ I-β-CIT 74 kBq,在注射¹²⁵ I-β-CIT后2 h时将各组小鼠断头处死,迅速取出脑组织,分离纹状体、大脑皮层、小脑、海马等,称组织湿重后,γ计数器测组织放射性,计算组织%ID/g。
4. 大鼠整体放射自显影。向正常SD大鼠尾静脉内注射0.1 mL ¹²⁵ I-β-CIT(3.7MBq)4 h后,迅速浸入-80 ℃丙酮与干冰的混合液中,然后用质量分数为8%的羧甲基纤维素制备的包埋剂包埋,-80℃冰箱中冷冻2 h,LKB-2250PMV大型推拉式冰冻切片机切片,切片厚度为40 μm,冰冻脱水干燥,用GS-250分子成像系统(核医学国家重点实验室提供)进行扫描,观察¹²⁵ I-β-CIT在大鼠体内和脑内的放射性分布。

结 果

1. ¹²⁵ I-β-CIT制备。过氧乙酸标记法和氯胺-T法的标记率分别为(53.4±7.9)%(n=7)和(88.4±3.49)%(n=6)。G254薄层层析与硅胶纸层析对游离¹²⁵ I和¹²⁵ I-β-CIT均有良好的分离度。2种标记方法的反应物经萃取纯化后放化纯度均>95%,¹²⁵ I-β-CIT和非标记β-CIT在薄层层析板上Rf值均为0.7(游离I₂ Rf=0.0),表明标记物是所期望的¹²⁵ I-β-CIT。稳定性实验表明,¹²⁵ I-β-CIT在无水乙醇中稳定性好,保存4周后,标记物的放化纯度仍大于90%。
2. 小鼠体内及脑内分布研究。¹²⁵ I-β-CIT经尾静脉注入后,迅速进入脑组织,脑摄取高峰出现在注射后15min, 药物入脑量为注射剂量的16%左右,早期肺肾摄取较高,5 min内即达到高峰,然后迅速下降,肝脏于15min达到高峰,但清除缓慢(表1)。小鼠脑内分布研究表明:药物主要浓聚于纹状体,其次为海马和大脑皮层,小脑放射性最低。纹状体摄取高峰出现在注药后2h(图1),此时纹状体/小脑放射性比值-1(STA/CB-1)为2.2,随时间延长,STA/CB-1值逐渐增加,在6和12h分别达5.0和8.1。

图1 ¹²⁵ I-β-CIT小鼠脑区不同时相的放射性分布

表1 ¹²⁵ I-β-CIT小鼠体内分布(±s) %ID/g

3. ¹²⁵ I-β-CIT小鼠脑内结合抑制实验。GBR-12909组小鼠纹状体内STA/CB-1值显著低于生理盐水组(t=6.424，P<0.001),而大脑皮层和海马内的放射性与小脑比值-1(CE/CB-1和HP/CB-1 )与生理盐水组相比差异无显著性；在clomipramine组纹状体内的放射性STA/CB-1值与生理盐水组相比差异无显著性,而在海马、大脑皮层内CE/CB-1和HP/CB-1值与生理盐水组相比放射性明显减低(t=3.665,P<0.01，图2)。

图2 GBR12909与clomipramine对¹²⁵ I-β-CIT的脑内抑制作用

4.大鼠整体放射自显影。大鼠整体放射自显影可见放射性在脑、心、肺、肾、肝脏、胃肠等均有放射性分布,肝脏和肠道放射性浓聚较高,在脑内也有很高的放射性浓聚(图3)。

图3 ¹²⁵ I-β-CIT大鼠整体放射自显影

讨 论

一般认为,低浓度过氧乙酸作为氧化剂具有氧化作用温和、易于控制和反应副产物低等优点。过氧乙酸进行标记的标记率为53.4%,较文献值^[4] 略低,可能与不同实验条件有关。氯胺-T法标记率优于过氧乙酸法,有易于获得、标记率高、重复性好、使用安全等优点。在进行标记物纯化时,我们用了简单萃取法,用乙醚替代乙酸乙酯,缩短了制备时间。本法制备的¹²⁵ I-β-CIT放化纯度>95%,经薄层色谱鉴定无放射性杂质存在,且稳定性4周内保持在90%以上,表明该法能获得稳定的标记品。
¹²⁵ I-β-CIT小鼠体内与脑内分布研究表明,¹²⁵ I-β-CIT可迅速通过血脑屏障,在纹状体内有较高的浓聚,有很高的靶与非靶比值。GBR12909是一种选择性DA重吸收抑制剂,与DAT有较强的亲和能力。小鼠注射GBR12909后,纹状体内STA/CB-1值显著降低,表明¹²⁵ I-β-CIT在纹状体内主要结合于DAT上；而大脑皮层和海马的放射性与小脑比值-1与生理盐水组差异无显著性,与该脑区DAT分布较少是一致的。Clomipramine为选择性的5-羟色胺转运蛋白(5-HTT)重吸收抑制剂,实验结果表明clomipramine不能抑制纹状体内的放射性,而明显抑制海马、大脑皮层的放射性。
¹²⁵ I-β-CIT大鼠整体放射自显影结果表明,标记物在大鼠体内放射性分布特征与小鼠体内分布结果基本一致。放射性在大鼠脑内浓聚较高,提示标记物有较高的入脑量,肝脏、胃肠等也有较高放射性分布,表明标记物主要经消化道排泄。

作者单位：沈鸣华(上海医科大学药学院放射药学研究室)
钱隽(上海医科大学药学院放射药学研究室)

参 考 文 献

1，Thakur M, Defulvio J.Determination of reduced disulfide groups in monoclonal antibodies. Biotechniques, 1990,8:512.
2，Rosebrough S. Pharmacokinetics and biodistribution of radiolabeled avidin,streptavidin and biotin. Nucl Med Biol, 1993, 20:663-668.

(收稿日期：1999-07-26 ) , http://www.100md.com

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