关键词：心肌缺血；预适应；细胞，培养的；MIBI；铊放射性同位素
摘要 目的 探讨缺氧预适应对心肌细胞摄取与清除99 Tcm -甲氧基异丁基异腈(MIBI)和201 Tl的影响。方法 在原代培养心肌细胞基础上，建立缺氧预适应模型，通过台盼蓝染色方法计算细胞存活率。测定心肌细胞对99 Tcm -MIBI和201 Tl在不同时间点的参入和释放量，观察正常心肌细胞、经预适应后具有保护功能的心肌细胞以及缺氧/复氧后细胞对放射性药物的摄取情况。结果 与缺氧/复氧组比较，缺氧预适应提高心肌细胞存活率20%[(75.31±3.45)%和(55.50±3.13)%,P<0.01]。正常心肌细胞浓聚99 Tcm -MIBI达坪值的半峰值时间为12.8min，浓聚201 Tl达坪值的半峰值时间为6.5 min。与正常对照组比较，缺氧预适应增加心肌细胞摄取99 Tcm -MIBI的量[(6103±170和4 852±491) 计数. min-1. mg-1 protein，P<0.05]，减少201 Tl摄取量[(2 120±202和3 190±183)计数. min-1. mg-1 protein,P<0.05]。预适应心肌细胞对99 Tcm -MIBI和201 Tl的清除均延迟。结论 缺氧预适应对心肌细胞具有保护作用，预缺氧能影响心肌细胞对99 Tcm -MIBI和201 Tl的浓聚与清除。
Experimental study of hypoxicpreconditioning on 99 Tcm -MIBI and 201 Tl kinetics incultured neonatal rat cardiomyocytes
LI Gang,QIAO Hongqing,MA Xingrong,et al.
Xijing Hospital,the Fourth Military Medical University,Xi'an 710032
Abstract Objective Tostudy the effect of hypoxic preconditioning (HPC) on 99 Tcm -MIBIand 201 Tl kinetics in cultured neonatal rat cardiomyocytes.Methods Theprotection of HPC was assayed on the model of hypoxia/reoxygenation(H/R) of culturedneonatal rat cardiomyocytes and the Trypan blue exclusion method was used to assess cellviability.Normal,hypoxic preconditioning and hypoxia/reoxygenation cardiomyocytes groupswere studied.By measuring the diffused and released radioactivity of myocytes in differenttime intervals,the effect of HPC on 99 Tcm -MIBI and 201 Tluptake and clearance kinetics in the myocytes was observed in various conditions.Results Comparedwith H/R,the number of viable cells after HPC [(75.31±3.45)% vs (55.50±3.13)%,P<0.01]was greatly increased.Normal cardiomyocytes showed uptake of 99 Tcm -MIBIand 201 Tl to a plateau level with a half-time of 12.8 min and 6.5 min, respectively. HPCcaused a significant increase in uptake of 99 Tcm -MIBI[normalcontrol,(4 852±491) counts. min-1. mg-1 proteinto HPC group,(6 103±170) counts. min-1. mg-1 protein;P<0.05],but depressed 201 Tl uptake [normal control,(3 190±183)counts. min-1. mg-1 protein to HPC group,(2120±202) counts. min-1. mg-1 protein;P<0.05].The clearances of 99 Tcm -MIBI and 201 Tl wereboth retarded.Conclusions These results suggested that the neonatal ratcardiomyocytes after HPC offered more capacity to tolerate the H/R damage and HPC couldinfluence the 99 Tcm -MIBI and 201 Tl uptake and clearance.
Key words Myocardial ischemia Preconditioning Cells,cultured MIBI
Thallium radioisotopes
心肌灌注显像剂99 Tcm -甲氧基异丁基异腈(MIBI)和201 Tl已广泛用于临床。为探讨心肌细胞对99 Tcm -MIBI和201 Tl的摄取和清除在缺氧预适应(hypoxicpreconditioning,HPC)中的变化及其对显像结果的影响,我们在原代培养乳鼠心肌细胞的基础上建立HPC模型,观察HPC后心肌细胞对99 Tcm -MIBI和201 Tl的浓聚与清除,现报道如下。
材料和方法
1.心肌细胞培养。参照McCall[1] 方法,无菌取出生后24～48h SD大鼠左室心尖部组织,切成1～2 mm碎片,用0.1%胰蛋白酶37 ℃消化,利用差速贴壁分离法纯化心肌细胞,用含体积分数为20%的胎牛血清的最低必需培养液(MEM)稀释成1×106 cell/mL,接种于预先放置有24 mm×24 mm盖玻片的六孔培养板中。在CO2 培养箱(Napco302)中培养24 h细胞贴壁,48 h呈单层同步搏动。实验组与对照组用同批收取的培养72h的心肌细胞。
2.HPC模型的制备。于实验前24 h换为无血清MEM培养液,24 h后随机分组分别进入下述实验：①缺氧/复氧(H/R)组,参照Webster等[2] 方法将六孔培养板置于95%N2 -5%CO2 平衡的缺氧容器内(37℃)2 h,然后放回CO2 培养箱(95%空气加5%CO2 的混合气体)进行复氧保温1h;②HPC组,预缺氧20 min,再放回CO2 培养箱中恢复20 min,然后按①组程序操作;③对照组为培养板置CO2 培养箱中持续保温3h。台盼蓝染色,光镜下计数细胞存活率。4次实验,每次双平行孔。
3.正常心肌细胞对99 Tcm -MIBI和201 Tl的浓聚与清除。心肌细胞对放射性药物的浓聚(参入试验)：参照Maublant等[3] 的方法,从六孔培养板中取出含心肌细胞的盖玻片,放入含37kBq 99 Tcm -MIBI或201 Tl的培养液37 ℃培养,分别于2、5、10、20、30、45、60、90min(n=5)取出盖玻片,4℃ PBS(pH值7.2)冲洗3次(空白对照实验本法可除去97%以上的胞外活性),橡皮刷刮下细胞,1mL质量浓度为0.1%的十二烷基硫酸钠(SDS)溶液冲洗3次,共3 mL,收集于5 mL试管中,用Cap-Ria16型γ计数仪测定放射性,以紫外吸收法测定细胞蛋白质含量(日本,UV-265型),以计数. min-1. mg-1 蛋白质表示细胞摄取量。
心肌细胞对放射性药物的清除(释放试验)：将含心肌细胞的盖玻片放入含37kBq 99 Tcm -MIBI或是201 Tl的培养液,37 ℃培养30min,取出后用4℃ PBS冲洗3次,再放入不含放射性药物的培养液37 ℃培养,分别于2、5、10、20、30、45、60、90min(n=5)取出盖玻片。为避免不同时间点的相互干扰,每个培养孔放1张含心肌细胞的盖玻片,每5min更换1次培养液。测定方法同前。
4.HPC后心肌细胞对99 Tcm -MIBI和201 Tl的浓聚与清除。于实验前将细胞预缺氧20min,复氧20 min,然后进行参入或释放实验,实验方法同对照组。整个实验在90min内完成。
5.H/R后心肌细胞对99 Tcm -MIBI和201 Tl的浓聚与清除。将细胞缺氧2h,复氧1 h,然后进行参入或释放实验。实验方法同对照组。
6.SD乳鼠由第四军医大学实验动物中心提供,201 TlCl由中国原子能科学研究院提供。MIBI购于北京师范大学应用化学研究所,标记时每瓶加入8.88GBq的新鲜99 Tcm O- 4 淋洗液5 mL,100℃水浴煮沸10min,经聚酰胺薄层测定放化纯度及标记率,分别为(97±1.2)%和(98±0.9)%。MEM为LifeTechnol Inco产品,SDS为Sigma产品,胰蛋白酶为Gibco公司产品，余为市售分析纯产品。实验结果以
±s表示。两组间均数比较用t检验。
结果
1.HPC对心肌细胞H/R的影响。实验前各组细胞存活率大于96%,实验结束时,H/R组与对照组比较细胞存活率下降40%[(55.50±3.13)%与(96.23±2.16)%,t=30.294，P<0.01];HPC组与H/R组比较,细胞存活率提高20%[(75.31±3.45)%与(55.50±3.13)%,t=12.029，P<0.01]。
2.HPC对心肌细胞浓聚与清除99 Tcm -MIBI的影响。如图1所示,正常状态下(37℃,pH值7.4)心肌细胞对99 Tcm -MIBI的浓聚(单位为计数. min-1. mg-1 蛋白质,下同)于59.2min达坪值(4 852±491),半峰值时间为12.8 min;HPC增加心肌细胞对99 Tcm -MIBI的浓聚,坪值与对照组差异有显著性(6103±170与4 852±491,t=6.804,P<0.05)。H/R组心肌细胞摄取99 Tcm -MIBI坪值比对照组略微增加,但差异无显著性(t=2.143,P>0.05),与HPC组相比差异有显著性(5277±271与6 103±170,t=7.294,P<0.05)。HPC对心肌细胞清除99 Tcm -MIBI的影响:正常、H/R和HPC状态下心肌细胞在10min时清除进入细胞的99 Tcm -MIBI分别达58.6%、53.5%和40%,60min时分别为82.1%、81.6%和71.4%。
3.HPC对心肌细胞浓聚与清除201 Tl的影响。如图2所示,正常状态下(37℃,pH值7.4)心肌细胞对201 Tl的浓聚于29.4 min达坪值(3 190±183),半峰值时间为6.5min;HPC时心肌细胞对201 Tl的浓聚减少,坪值与对照组的差异有显著性(2120±202与3 190±183,t=11.093,P<0.05)。H/R组心肌细胞摄取201 Tl坪值与HPC组相似,低于对照组(2273±131与3 190±183,t=11.512,P<0.05)。HPC对心肌细胞清除201 Tl的影响:正常、H/R和HPC状态下心肌细胞在10min时的清除百分数分别为88.0%、87.0%和71.7%,60 min时分别为96.9%、97.7%和96.8%。
图1 HPC对心肌细胞摄取99 Tcm -MIBI的影响
图2 HPC对心肌细胞摄取201 Tl的影响
讨论 预适应是指短暂预缺血可以减轻后继较长时间缺血所造成的心肌损伤现象,具体表现为缩小心肌缺血的范围,减轻再灌注引起的心律失常,改善缺血后心肌的收缩功能。预适应不仅存在于活体组织的完整器官,也存在于体外培养的细胞水平[2] 。预适应的心肌保护机制尚不完全清楚。本实验在制备HPC模型时,分别观察了5、10、20、30和40min 5个缺氧时间段的预适应效果,结果显示细胞存活率分别为61.00%、57.50%、75.31%、68.20%和60.45%,表明原代培养的乳鼠心肌细胞在短暂缺氧20min后其心肌保护作用最明显,故在后续实验中采用预适应20 min方案。
预适应的1个重要特征是保护作用的时相性,即短暂的缺血与后继的长时间缺血之间必须有1个再灌注的间隔,这一间隔的长短影响保护作用的效果,间隔时间超过一定的阈值将使HPC诱导的保护作用消失[4] 。我们的预实验结果显示,原代培养的乳鼠心肌细胞在首次短暂缺血后20～110min,预适应作用比较明显。故选用复氧20 min作为参入和释放试验的开始时间点。
尽管201 Tl和99 Tcm -MIBI的结构、性能迥异,被心肌细胞摄取的机制也完全不同,但是显像结果都能揭示心肌血流灌注的特征。临床医生在解释图像时,并不考虑不同显像剂可能产生的影响。本实验发现，HPC后心肌细胞与对照组相比，对99 Tcm -MIBI的浓聚增加、清除减慢,对201 Tl的浓聚和清除均显示延缓;H/R组心肌细胞摄取99 Tcm -MIBI与对照组相似,变化不明显。对201 Tl而言,H/R组心肌细胞摄取情况与HPC组比较接近。如果类似的结果能在活体器官的心肌组织重复,则意味着HPC后心肌灌注显像时,2种显像剂的显像结果可能会有差异。
继往的研究发现,99 Tcm -MIBI心肌摄取与其阳离子特征、心肌细胞膜蛋白和跨膜电位有关,而201 Tl的摄取与细胞膜上的Na+ /K+ -ATP酶的活性、pH值以及细胞内ATP浓度有关。有资料表明,99 Tcm -MIBI的浓聚可能与胞外的酸碱度及能量代谢状态无关[5] 。但我们认为H/R组心肌细胞摄取99 Tcm -MIBI情况与对照组相似,不排除附着在盖玻片上的坏死细胞脱落而仅剩正常活力的细胞摄取显像剂的影响。H/R组心肌细胞摄取201 Tl量与对照组相比明显减少,可能与H/R抑制了Na+ /K+ -ATP酶有关[6] 。预适应后心肌细胞代谢方式的改变可能导致对2种显像剂浓聚与清除动力学的影响。Wolfe等[7] 发现在预适应产生后的一段时间里,心肌细胞膜的结构和通透性改变,细胞内糖原减少,糖原储备量的恢复时程与预适应保护作用消失的时程相一致,认为预适应后细胞内的糖原减少可降低其后较长时间缺血所致的细胞酸化、pH值下降以及ATP的消耗,从而减低心肌损伤的程度。本实验结果与此理论相吻合。
志谢 本实验得到第四军医大学口腔医学院口腔生物学教研室吴军正主任、基础部解剖教研室张淼丽主管技师的大力支持和协助
本课题获陕西省自然科学基金资助(基金编号：98SM44)
参考文献
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2 Webster KA,Discher DJ,Bishopric NH.Cardioprotection in an in vitro model of hypoxicpreconditioning.J Mol Cell Cardiol,1995,27:453-458.
3 Maublant JC,Gachon P,Moins N.Hexakis (2-methoxy isobutylisonitrile) 99 Tcm and 201 Tl chloride:uptake and release in cultured myocardial cells.J NuclMed,1988,29:48-54.
4 Murry CE,Jennings RB,Reimer RA,et al.Preconditioning with ischemia: a delay oflethal cell injury in ischemic myocardium.Circulation,1986,74:1124-1136.
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(收稿：1998-10-03 修回：1999-04-25) , 百拇医药