重症肌无力胸腺和外周血抗原特异性单个核细胞IFN-γ、IL-4的转录及表达^△

http://www.100md.com 《中国神经免疫学和神经病学杂志》 1999年第2期

国 红 孙 宏 许贤豪 王 红 张 华 李宝林 叶 霜 陈 品 吴良洪^* 孙耀光^* (卫生部北京医院神经科， 北京 100730) 中国神经免疫学和神经病学杂志 1999 0 6 2
关键词：重症肌无力；胸腺；IFN-γ；IL-4；mRNA 期刊 zgsjmyxysjbxzz 0 论著 fur --> /literature/library/imagebase/imagebase03.asp?keyword=重症肌无力；胸腺；IFN-γ；IL-4；mRNA /literature/clinic/diagnose/diagnose02.asp?keyword=重症肌无力；胸腺；IFN-γ；IL-4；mRNA /info/meeting/meeting02.asp?keyword=神经病学

摘要 目的 为了解重症肌无力(MG)胸腺细胞免疫状态，对10例行胸腺摘除(Tx)的MG患者及4例先天性心脏病行开胸手术患者的胸腺和外周血单个核细胞经特异性抗原乙酰胆碱受体(AChR)刺激后，其细胞IFN-γ和IL-4的mRNA转录和细胞培养上清液中的蛋白表达情况进行了检测。方法 采用RT-PCR结合狭缝印迹杂交检测IFN-γ、IL-4mRNA转录，采用ELISA检测IFN-γ和IL-4的表达情况。结果 10例MG患者的胸腺和外周血单个核细胞经AChR刺激后IFN-γ和IL-4的mRNA转录增高，其中8例胸腺增生者胸腺细胞和外周血细胞的IFN-γmRNA转录、外周血细胞的IFN-γ表达均高于健康对照组(P<0.05)；胸腺细胞IL-4mRNA转录和表达均高于健康对照，差异有显著性(分别为P<0.01和P<0.05)，而外周血细胞IL-4mRNA转录和表达与健康对照差异无显著性(P>0.05)；另2例伴胸腺瘤者，此两种细胞因子无论mRNA转录还是蛋白表达均很低。外周血细胞与胸腺细胞IL-4mRNA转录有一定的相关性，基本反映胸腺的免疫学变化。结论 胸腺增生MG患者的细胞免疫(Th1和Th2)高度活跃，PBMC的有些免疫学参数能反映MG患者胸腺的免疫学改变，但有待进一步累积更多资料。伴胸腺增生与伴胸腺瘤的MG发病机制可能不同，Tx是必要的。

中图号 R746.1 R322.5⁺ 3

Study on mRNA Expressionof IFN- γ and IL-4 andTheir Proteins Secretion of Thymocytes and Peripheral Blood Mononuclear Cells in Patients
with Myasthenia Gravis

Guo Hong Sun Hong Xu Xianhao Wang Hong Wang Xiuyun, et al
(Department of Neurology, Beijing Hospital,The Ministry of Healthy, Beijing 100730)

Objective To study the cell-mediated -immunity of thymus in MG patients, mRNA expression of IFN- γ and IL-4, and protein secretion of the peripheral blood mononuclearcells (PBMC) and thymocytes in 10 MG patients and 4 healthy controls (HC) were studiedafter specifically stimulated with AChR. mRNA expression of IFN- γ and IL-4 of the PBMC and thymocytes in 10 MG patients and 4 HC wasstudied by RT-PCR and slot blot. The protein secretion of IFN- γ and IL-4 was determined by ELISA. Results The mRNAexpressions of IFN- γ and IL-4 in the PBMC and thethymocytes were raised, and IFN- γ secretion weresignificantly higher than those in HC, The expression of IL-4 and IL-4 secretion washigher than that in HC in thymocytes, but did not reach the statistically significantlevel in PBMC, in 8 MG patients with hyperplasia (HP). But those were lower than HC inother two patients with thymoma. The mRNA expression of IL-4 was closely correlatedbetween in the PBMC and thymocytes. Conclusions The cell-mediatedimmunity (both Th1 and Th2) in the thymuses of MG patients with HP is highly active. Theimmune mechanism of MG patients with HP is different from that with thymoma. And some ofthe immune parameters of the PBMC might reflect the immune changes in the thymus of MGpatients, but needed to be further explored. The immunopathogenesis between patients withHP might be different. Thymectomy for those patients was necessary.
Key words myasthenia gravis; thymus; IFN- γ; IL-4; mRNA

重症肌无力(MG)是乙酰胆碱受体抗体(AChRAb)针对神经肌肉接头突触后膜上乙酰胆碱受体(AChR)进行破坏而引起的一种获得性自身免疫疾病。曾一度认为体液免疫异常是MG的唯一致病因素，但近年来越来越多的研究表明细胞免疫也参与了MG的发病过程。像其它自身免疫疾病一样，MG的始发部位至今不明，但目前认为胸腺的可能性最大，因为约75%的MG患者伴有胸腺异常，其中85%为胸腺增生，15%为胸腺瘤^[1] ，而胸腺摘除(Tx)后多数患者病情好转。研究发现，MG患者增生的胸腺内存在大量AChR特异应答性T、B细胞，且远较外周血为多^[2] ；研究还发现胸腺细胞可分泌IL-2、IL-1、IL-6等细胞因子^[3，4] ，提示MG患者胸腺存在免疫学改变。但临床发现Tx并非对所有MG患者均有效，有些伴胸腺瘤患者甚至于Tx后病情会加重^[5] ，还有一部分MG患者胸腺病理检查正常，故探讨不同病理表现MG患者的胸腺组织细胞免疫学活性有否差异，外周血相应的免疫参数能否反映胸腺的免疫学变化，不仅有利于对MG始发部位的进一步认识，而且有利于治疗方案的个体化。
根据分泌细胞因子的不同，将辅助性T细胞(Th)分为Th1和Th2两个亚类，IFN-γ主要由Th1分泌，IL-4主要由Th2分泌。同时检测了10例行Tx的MG患者胸腺细胞和外周血单个核细胞(PBMC)在特异性抗原(AChR)刺激下IFN-γ、IL-4mRNA的转录情况，并同时检测了细胞培养上清液中两种细胞因子的蛋白表达，试图在分子水平上，从细胞因子角度了解MG患者胸腺细胞免疫活性。

1 材料和方法
1.1 研究对象 10例列入研究的均为于胸外科行Tx的北京医院神经科住院MG患者，男6例和女4例，年龄13～57(38.3±15.9)岁，病程50天～5(1.35±1.57)年。术前行纵隔CT检查示：胸腺增生4例，胸腺瘤2例，正常萎缩3例，另1例未能确定胸腺瘤或增生。Tx后病理证实2例为胸腺瘤，余8例均为胸腺增生。1例于术前用了激素，余9例均未曾用过免疫治疗。
4例正常胸腺均为先天性心脏病患者行开胸手术者(阜外医院)，男、女各2例，年龄9～39(24.5±14.3)岁。
1.2 实验方法
1.2.1 外周血及胸腺单个核细胞的分离及培养：取静脉抗凝血10 mL，密度梯度离心法提取单个核细胞。胸腺经生理盐水冲洗干净后，剪碎，筛网过滤，分离细胞。粗提的人腓肠肌AChR^[6] ，采用“固相抗原法”纯化^[7] 。将细胞加到结合有AChR的96孔细胞培养板中，每孔3×10⁵ 个细胞/100μL，在37℃、5% CO₂ 孵育6 h后收集部分细胞；其余继续培养48 h后离心，收集上清液，冻于-80℃备用。
1.2.2 RT-PCR结合狭缝印迹杂交检测IFN-γ和IL-4 的 mRNA转录：一步法提取细胞总RNA。加鸟型逆转录酶，42℃水浴，1h反应得cDNA。分别加入MgCl₂ (25 mmol/L)、4种dNTP混合物(2.5 mmol/L)、上下游引物(15 pmol/μL)、cDNA 5 μL，总体积25 μL。95℃预变性5 min，加入1 U Taq DNA聚合酶，在热循环仪上进行PCR反应，条件为94℃变性30s，72℃延伸45 s，退火温度分别为IFN-γ 54.5℃、IL-4 58℃、β-actin 65℃，均为30s。循环35次，72℃延伸10 min。反应产物于15 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。
将PCR产物95℃变性后经狭缝加样器点样于硝酸纤维素膜。取膜经预杂交后加DIG标记的探针杂交，洗膜，封闭，加抗DIG抗体反应30min后，加入底物工作液，避光反应1 h，TE终止反应。结果用激光密度扫描仪检测。
1.2.3 结果计算：以“相对单位”表示PCR扩增产物的量，β-actin作为内对照。计算公式：

1.2.4 统计学处理：使用Excel 7.0统计软件，用t检验，相关回归等处理有关资料。

2 结果
2.1 IFN-γ 本组10例MG患者胸腺细胞和PBMC经AChR刺激后，IFN-γ mRNA转录量及其蛋白表达量虽高于健康对照，但差异无统计学意义(P>0.05)。对8例病理报告为增生者进行分析发现，胸腺细胞和PBMC的IFN-γmRNA转录量高于健康对照(P<0.05)，同时发现PBMC IFN-γ的表达量也高于健康对照(P<0.05)。而另2例病理诊断为“胸腺瘤”的MG患者，其胸腺细胞和PBMC IFN-γ mRNA转录和表达均低于健康对照，无统计学意义(P>0.05)(表1)。

表 1 IFN-γ的转录和分泌情况
Table 1 Expression of IFN-γ mRNA and secretion of IFN-γ

*P<0.05 comparison with healthy controls

2.2 IL-4 本组胸腺细胞IL-4 mRNA转录量及其蛋白表达量均高于健康对照组(P<0.05)，而PBMC则无明显区别(P>0.05)。胸腺增生者胸腺细胞IL-4mRNA转录量明显高于健康对照(P<0.01)，其蛋白表达量也高于健康对照(P<0.05)，而胸腺瘤患者胸腺细胞和PBMC的IL-4mRNA转录及表达与健康对照无明显区别(P>0.05)(表2)。

表 2 IL-4的转录和分泌情况
Table 2 Expression of IL-4 mRNA and secretion of IL-4

*P<0.05，**P<0.01 compared with healthy controls

2.3 胸腺和外周血相关性
2.3.1 IFN-γ：10例患者胸腺细胞和PBMC IFN-γ mRNA的转录量和表达量的相关性(r分别为0.49和0.46，P>0.05)无统计学意义。
2.3.2 IL-4：10例患者胸腺细胞和PBMC IL-4 mRNA转录量间明显相关(r=0.84，P<0.01)。胸腺细胞和PBMCIL-4蛋白表达量相关不密切(r=0.21，P>0.05)。

3 讨论
3.1 胸腺不同的病理改变者有不同的临床表现、免疫学异常和转归 胸腺是T细胞发育、成熟的部位，在MG发病机制中的重要作用早已为人所认识，而且现被认为Tx是MG的首选治疗方案^[8] 。但同时发现不同胸腺病理表现的患者其临床表现和实验室检查均有许多差异，本结果也支持这一点。
本组中8例为胸腺增生，其抗原特异性单个核细胞IFN-γ和IL-4的mRNA转录量和IFN-γ蛋白表达量高于健康对照，而2例胸腺瘤者这两种细胞因子mRNA转录量均很低，胸腺摘除术后其临床疗效差，需辅以其它免疫治疗。
3.2 发病机制 有人推测伴有胸腺瘤的MG与伴胸腺增生的MG发病机制可能不同^[9，10] ，不仅二者在胸腺内的细胞组成与形态、发病年龄、性别不同，病情转归亦不同^[11] ，许多胸腺瘤患者于Tx后病情加重^[5，12] ，而且有些胸腺瘤患者于Tx前未表现有MG症状，仅是因非MG原因检查时发现胸腺瘤并于Tx后出现MG，有人推测胸腺瘤可产生某些抑制性因子^[13，14] ，抑制了自身免疫现象的发生，而Tx后这种抑制因子消失，故可诱发MG或加重原有的MG。尚有人报道胸腺瘤内有AChR特异性T细胞，但未见B细胞^[15] 。本实验中2例胸腺瘤患者AChR特异性单个核细胞IFN-γ和IL-4的mRNA转录量均很低，可能与胸腺瘤内免疫抑制因素的存在有关，也可能与病例数较少有关。而胸腺增生者胸腺内AChR特异性单个核细胞反映其活跃程度的IFN-γ、IL-4mRNA转录量增高。
3.3 胸腺和外周血免疫学异常的相关性 胸腺是免疫中心器官，MG患者主要病理和免疫学异常可能发生在胸腺。一般文献报道检测用外周血以了解MG患者的免疫学状态。但为使之更加令人信服，我们对胸腺和外周血有关免疫学异常进行了对比检测，以了解此两者间相关性。
本组8例胸腺增生者的胸腺和外周血中的细胞因子检测结果表明，IL-4mRNA转录明显相关；IFN-γ mRNA转录及其蛋白表达基本相关，但未达有统计学意义的程度；IL-4蛋白表达相关不密切。可能有些参数相关密切，另一些相关不密切，这方面有待进一步深入研究。
3.4 Th1和Th2细胞活性 IFN-γ由Th1细胞分泌产生，IL-4 由Th2细胞产生。IL-4是B细胞生长刺激因子，可刺激B细胞增殖、活化，转化成浆细胞并分泌抗体，从而增强体液免疫。在人类IFN-γ可增强IL-4的这种功能。本结果提示，MG患者增生的胸腺内Th1细胞和Th2细胞的免疫活性均增强，而且IL-4的增高在胸腺细胞和PBMC中有一定的相关性。
总之，本研究从另一个角度证明了MG患者胸腺存在免疫学异常，提示Tx对治疗MG是必要的；外周血免疫参数可基本反映胸腺细胞的免疫活跃程度，并可为临床治疗的个体化提供线索，但有待累积更多资料。

△ 卫生部课题基金(96-3-101)资助；*卫生部北京医院心胸外科

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(1998-09-16收稿) , http://www.100md.com(国 红 孙 宏 许贤豪 王 红 张 华 李宝林 叶 霜 陈 品 吴良洪^* 孙耀光^*)

    百拇医药网 http://www.100md.com/html/DirDu/2005/07/06/65/86/67.htm