当前位置: 首页 > 期刊 > 《中国普外基础与临床杂志》 > 2000年第1期
编号:10647084
长春新碱对5肽胃泌素促人结肠癌细胞株SW480增殖的影响及其临床意义
http://www.100md.com 《中国普外基础与临床杂志》 2000年第1期
长春新碱对5肽胃泌素促人结肠癌细胞株SW480增殖的影响及其临床意义
长春新碱对5肽胃泌素促人结肠癌细胞株SW480增殖的影响及其临床意义

谢斌 何双梧 王代科 第三军医大学大坪医院野战外科研究所普外科 重庆 400042 中国普外基础与临床杂志 2000 0 7 1
关键词:长春新碱;胃泌素;结肠癌;细胞株 期刊 zgpwjcylczz 0 3-5 基础与实验研究 fur -->

摘 要:目的 从细胞信号传导方面探讨长春新碱抑制胃泌素促人结肠癌细胞株SW480增殖的机理及临床意义。方法 采用噻唑氮蓝(MTT)比色分析法、3 H-肌醇掺入法及Ca2+ 荧光测定技术和γ-32 P-ATP掺入法,在体外观察长春新碱(VCR)对5肽胃泌素(PG)促人结肠癌细胞株SW480增殖的影响。结果 PG+VCR组的SW480细胞活细胞数降低,与对照组相比P<0.01,与PG组相比P<0.01;PG+VCR组细胞内三磷酸肌醇及Ca2+ 浓度降低,与PG组相比P<0.01,与对照组相比P>0.05;PG+VCR组膜蛋白激酶活性降低,与PG组相比P<0.05,与对照组相比P>0.05。结论 长春新碱可能通过肌醇脂质信号通路而影响胃泌素促人结肠癌细胞株SW480的增殖,从而为结肠癌的抗信息传导治疗提供了实验依据。
分类号: R329.2+ 8;R735.3+ 5;R979.1 文献标识码: A
文章编号: 1007-9424(2000)01-0003-03

EFFECTS AND CLINICAL SIGNIFICANCE OF VINCRISTINE IN GASTRIN-STIMULATING CELL PROLIFERATION ON HUMAN COLONIC CANCER CELL LINE SW480

XIE Bin,HE Suang-wu,WANG Dai-ke.
(Department of General Surgery,Research Institute of Field Surgery,Daping Hospital,Third Military Medical University,Chongqing 400042)

Abstract: Objective To investigate the mechanism and clinical significance of vincristine (VCR) inhibiting gastrin-proliferation effects on human colon cell line SW480.Methods Effects of VCR on the viable cell count (A value),myoinositol triphosphate (IP3 ,CPM value),〔 Ca2+ i and protein kinase C (PKC) activity of human colon cell line SW480 were evaluated in vitro by MTT assay,3 H-myo-inositol incorporation,fluorescence measurements and γ -32 P-ATP incorporation.Results A value of VCR+PG group was lower than that of PG or control group (P< 0.01 vs control,P< 0.01 vs PG).The concentration of IP3 or 〔 Ca2+ i in VCR+PG group was lower than that in PG group (P< 0.01 vs PG); and the PKC activity of membrane was lower than that in PG group (P< 0.05 vs PG,P> 0.05 vs control).Conclusion Effects of vincristine may be through the phosphoinositide signaling pathway on gastrinstimulating cell proliferation in human colon cell line SW480.It has provided an experimental evidence for antisignaling therapy for patients with colon cancer.
Key words
Vincristine Gastrin Colon cancer Cell line▲

采用噻唑氮蓝(MTT)比色分析法、3 H-肌醇掺入法及Ca2+ 荧光测定技术和γ-32 P-ATP掺入法,在体外观察长春新碱(vincristine,VCR)对5肽胃泌素(pentagastrin,PG)促人结肠癌细胞株SW480增殖的影响,以从细胞信号传导方面探讨长春新碱抑制胃泌素促人结肠癌细胞株SW480增殖的机理及临床意义。

1 材料与方法
1.1 材料
PG(上海丽珠生化试剂公司);VCR(广州明兴药厂);3 H-myo-肌醇(中国科学院上海原子能研究所);Fura-2/AM(SIGMA);MTT(FLUKA,瑞士);RPMI 1640培养基(GIBCO);人结肠癌细胞株SW480(美国纪念斯隆-凯特林癌症中心);PS、HistoneⅢ-s(Sigma公司);γ-32 P-ATP(北京亚辉公司)。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 人结肠癌细胞株SW480培养于含10%小牛血清的RPMI 1640培养液中,37℃、5% CO2 条件下生长,细胞培养至对数生长期时接种在培养瓶中继续培养,选择合适时相实验。
1.2.2 实验分组 实验分为对照组、PG组、PG+VCR组。
1.2.3 细胞内蛋白激酶C(PKC)活性测定 采用同位素酶解法〔1〕
1.2.4 细胞内三磷酸肌醇(IP3 )测定 按文献〔2〕方法,并略加改进。在细胞悬液(1×106 个/ml)中加入3 H-肌醇(IP3 ) 5 μCi/ml,孵育18小时,20 mmol/L LiCl作用2小时,然后加入不同处理因素作用1分钟,氯仿/甲醇(V/V,1∶2)终止反应抽提肌醇磷酸。Dowexl×8AG型微型阴离子交换层析柱分离IP3 ,采用液闪计数仪测其每分钟放射性计数(cpm)。
1.2.5 细胞内Ca2+ 测定 按文献〔3〕方法并略加改进。在细胞悬液(1×106 个/ml)中加入5 μmol/L Fura-2/AM,混匀,孵育60分钟,800 r/min离心5分钟,弃培养液,平衡盐溶液重悬。置石英杯,37℃测其340/380 nm的荧光强度值;加入不同处理因素后测其荧光强度值F,再依次加入0.1% Triton X-100,3 mmol/L乙二醇双四乙酸,分别测得最大荧光强度值Fmax 、最小荧光强度值Fmin ,按下列公式计算〔Ca2+ i

1.2.6 活细胞数(VCC)测定 采用MTT比色分析法〔4〕
1.3 统计学处理
实验以Excel 6.0版专用统计分析程序对各组数据进行单因素方差分析,以P<0.05表示差异有显著性意义,P<0.01表示差异有极显著性意义,结果以表示。

2 结果
2.1 PG对人结肠癌细胞株SW480 VCC、IP3 、〔Ca2+ i 和PKC活性的影响
当PG浓度为25 μg/ml时,VCC(A值)增加显著,与对照组相比差异有高度显著性意义(P<0.01);IP3 (cpm值)增高最明显,与对照组相比,差异也有高度显著性意义(P<0.01);细胞内Ca2+ 浓度比对照组有显著增高(P<0.01);细胞膜与细胞质PKC的活性,与对照组比差异均有显著性意义(P均<0.05),见表1。

表1 PG对人结肠癌细胞株SW480 VCC、IP3 、〔Ca2+ i 及PKC活性的影响()

组别 VCC(A,n=8) IP3 (cpm,n=5) 〔Ca2+ i (nmol/L,n=5) PKC活性〔pmol/(min. mg蛋白),n=5〕
胞浆 胞膜
对照组 1.554±0.009 8.83±1.33 26.36±2.91 2.39±1.30 1.07±0.28
PG组(μg/ml)
6.25 1.555±0.005 10.16±1.33 30.61±2.16 2.36±0.84 1.09±0.16
12.50 1.563±0.010 11.18±0.75** 50.69±2.30** 2.30±0.45 1.15±0.15
25.00 1.580±0.011** 16.17±0.75** 101.44±2.49** 0.91±0.34* 2.65±1.21*
50.00 1.579±0.008** 14.10±1.60** 70.63±4.17** 0.92±0.26* 2.65±0.60*
100.00 1.578±0.010** 13.00±2.53** 62.59±2.59** 0.91±0.14* 2.66±0.68*

与对照组比较,*P<0.05;**P<0.01

2.2 PG与VCR合用时对人结肠癌细胞株SW480 VCC、IP3 、〔Ca2+ i 和PKC活性的影响
当PG(25 μg/ml)与VCR合用时,PG+VCR组VCC明显低于PG组及对照组(P<0.01);IP3 值及〔Ca2+ i 明显低于PG组(P<0.01);PG+VCR组细胞质与细胞膜PKC活性与对照组相比差异均无显著性意义(P>0.05),但与PG(25 μg/ml)组相比差异有显著性意义(P<0.05),见表2。

表2 PG与VCR合用时对人结肠癌细胞株SW480 VCC、IP3 、〔Ca2+ i 及PKC活性的影响()

组别 PG(μg/ml) VCR(μg/ml) VCC(A,n=8) IP3 (cpm,n=5) 〔Ca2+ i (nmol/L,n=4) PKC活性〔pmol/(min. mg蛋白),n=5〕
胞浆 胞膜
对照组 0.00 0.00 1.554±0.009 8.83±1.33 26.36±2.91 2.39±1.30 1.07±0.28
PG组 25.00 0.00 1.580±0.011** 16.17±0.75** 101.44±2.49** 0.91±0.34* 2.65±1.21*
PG+VCR组 25.00 1.25 1.519±0.026**△△ 9.33±3.83△△ 28.69±2.32△△ 2.26±0.49 1.09±0.15
25.00 2.50 1.512±0.009**△△ 8.60±2.30△△ 27.54±2.45△△ 2.35±1.02 1.08±0.11
25.00 5.00 1.484±0.009**△△ 8.67±1.51△△ 27.28±1.67△△ 2.31±1.05 1.11±0.25

与对照组比较,*P<0.05,**P<0.01;与PG组比较,△P<0.05;△△P<0.01

3 讨论
肌醇脂质信号系统在生物信号的跨膜传递方面起着重要作用,并与细胞增殖及肿瘤形成密切相关〔5〕 。许多激素、生长因子及神经递质依赖肌醇磷脂跨膜传导生物信号,它们作用于相应的胞膜受体,促使磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2 )迅速水解,生成第二信使IP3 和二酰甘油(DG),并通过IP3 /Ca2+ 和DG/PKC信号途径发挥其生物学效应。胃泌素即是其中之一〔6〕 。何双梧等〔7〕 曾报告胃泌素对大肠癌的促生长作用是通过胃泌素受体介导的。IP3 可介导细胞内储存的Ca2+ 的释放,而DG可激活PKC。胞浆中PKC活性下降是其激活和转位的标志。游离Ca2+ 的升高及PKC的活性增强都是重要的促有丝分裂信号。
抗癌药物通过干扰肌醇磷脂代谢而影响细胞有丝分裂信号传递,可能是其抑制肿瘤细胞增殖的机理之一。VCR是一种临床上常用于肿瘤化疗的药物,主要通过抑制细胞微管蛋白聚集和干扰细胞蛋白质、脂类、氨基酸及核酸代谢而起抗癌作用。吴波等〔8〕 研究发现,VCR不影响HL-60细胞磷脂酰肌醇(PI)激酶和磷脂酰肌醇一磷酸(PIP)激酶活性,但却迅速且持久地促进PI的水解;同时发现,VCR能明显抑制细胞增殖和DNA合成,提示VCR抑制HL-60增殖与干扰肌醇磷脂代谢有关。肌醇磷脂代谢很活跃,3种肌醇磷脂之间在激酶及磷酸酶作用下可以迅速地相互转化,在3种肌醇磷脂中PI含量最高,是肌醇磷脂代谢中的重要中间产物,它的水解必将削弱整个肌醇磷脂代谢过程。本实验以人结肠癌细胞株SW480细胞为体外培养模型,观察VCR在PG促SW480细胞中对细胞肌醇脂质信号通路的影响。结果发现,当PG浓度一定时(25 μg/ml),VCR浓度为1.25 μg/ml时,SW480细胞IP3 浓度降低,与对照组相比差异无显著性意义(P>0.05),与PG组相比明显降低,两者之差异有高度显著性意义(P<0.01),这就从另外一个角度说明了VCR干扰肌醇磷脂代谢,影响细胞增殖的机理。其原因可能为PI持续水解造成PIP和PIP2 减少,而PIP2 是生成IP3 、DG的直接前体,因此导致细胞中IP3 浓度下降。采用MTT比色法测定SW480活细胞数,结果显示,VCR+PG(25 μg/ml)组与PG组相比,活细胞数明显减少,差异有显著性意义(P<0.01),与对照组相比其差异则无显著性意义(P>0.05)。同时发现,VCR与PG合用时,SW480细胞中的Ca2+ 浓度、膜PKC活性与PG组相比明显降低(P<0.05),但与对照组相比差异则无显著性意义。提示VCR通过干扰细胞肌醇磷脂代谢而影响细胞增殖,这可能是其具有抗癌作用的机理之一。
本实验从细胞信号系统角度,说明了VCR抗肿瘤细胞增殖的机理,有助于加深对抗信息传导治疗的认识,为今后开发新的疗效高、专化性强、毒副作用小的药物提供有益的启迪。

作者简介:谢 斌(1969年-),男,四川省彭州人,硕士,主要从事胃肠肿瘤研究。

参考文献:

[1]Yassin RR,Murthy SNS.Possible involvement of protein kinase C in mediating gastrin-induced response in rat colonic epithelium〔J〕.Peptides,1991; 12(5)∶925
[2]Ishizuka J,Beauchamp RD,Townsend CM,et al.Receptor-mediated autocrine growth-stimulatory effect of 5-hydroxytryptamine on cultured human pancreatic carcinoid cells 〔J〕.J Cell Physiol,1992; 150(1)∶1
[3]Ishizuka J,Martinez J,Townsend CM,et al.The effect of gastrin on growth of human stomach cancer cells 〔J〕.Ann Surg,1992; 215(5)∶528
[4]武建国.实用临床免疫学检验〔M〕.第1版.南京:南京科学技术出版社,1989∶39
[5]Rana RS,Hokin LE.Role of phosphoinositides in transmembrane signaling 〔J〕.Physiol Rev,1990; 70(1)∶115
[6]Ishizuka J,Courtney MT,Richard JB,et al.Effects of gastrin on 3′,5′-cyclic adenosine monophosphate,intracellular calcium,and phosphatidylinositol in human colon cancer cells 〔J〕.Cancer Res,1994; 54(8)∶2129
[7]何双梧,谢尚奎,张连阳.胃泌素对原代培养人大肠癌细胞促增殖作用的研究〔J〕.中国普外基础与临床杂志,1998;5(3)∶143
[8]吴 波,梁念慈.长春新碱对HL-60细胞肌醇磷脂代谢和增殖的影响〔J〕.中国药理学通报,1993;9(3)∶210

收稿日期:1998-12-19

修稿日期:1999-03-15

, 百拇医药