关键词：超声；绒毛滋养细胞；Fas；FasL
摘 要 目的：检测诊断超声辐照与人早孕绒毛Fas/FasL蛋白表达的关系。方法：对拟进行人工流产的24例早孕(45～60d)妇女随机分为4组：对照组为空白照射组、10min组、20min组和30min组。应用Hp8500彩色多普勒超声诊断仪，经腹对孕囊进行不同时间的持续照射，照射后24h取材。用免疫组织化学技术检测上述各组绒毛滋养层细胞Fas/FasL蛋白表达情况。结果：超声照射后10min组绒毛滋养层细胞Fas/FasL蛋白表达率与对照组无差别(P>0.05)；20min组和30min组滋养层细胞表达率明显增加，显著大于对照组和10min组(P<0.001)。结论：诊断超声持续照射早孕孕囊组织>10min可引起绒毛滋养层细胞Fas/FasL蛋白表达率增加，从而诱导滋养层细胞凋亡增加。
Fas/FasL Protein Expression in First-trimester Pregnancy
Trophoblast after Diagnostic Ultrasound Irradiation
Du Lianfang, ZhangQingping
(Dept. Ultrasound, Tongji Hospital of Tongji Medical University, Wuhan 430030 China)
Liu Wangpeng
(The First Affiliated Hospital, Shanxi Medical University, Taiyuan China)
ABSTRACT Objective:Toinvestigate the role of Fas/FasL protein expression in first-trimester pregnancytrophoblast after diagnostic ultrasound irradiation.Methods：Twenty-four first-trimesterpregnancy women were randomly separated into egual four groups according to differentirradiating time:control group(bland radiation),10 min group, 20 min group and 30 mingroup. Gestational sac were irradiated by HP 8500 color Doppler ultrasonography with7.5MHz linear phased array transducer. All the trophoblasts were removed at 24 h after.Expression of Fas/FasL protein was analyzed with immunohistochemistry.Results:The positiverates of Fas/FasL protein in experiment groups 10 min group excluded were all higher. Therates of expression of Fas and FasL in control group trophoblasts were (32.56±5.23)%,(46.44±4.39)%respectively. After irradiation the positive rate was increased in 20 min group and 30mingroup,Fas expression peaking to(45.63±9.38)% in group 30min trophoblasts;FasL expressionpeaking to (54.05±8.67)% in group 30 min trophoblasts. There was no difference betweencontrol group and 10 min group (P>0.05). Conclusion:Continuous irradiation over 10minutes by diagnostic ultrasound may result in higher expression of Fas and FasL infirst-trimester prognancy, further inducing trophoblasts cell apoptosis resulted.
KEY WORDS Ultrasound Trophoblast Fas/FasL
Fas/FasL在动物性腺的分化增殖及生长发育方面起关键的调节作用，而对人类的胚胎发育有何影响，尚未见报道。本实验试图探讨Fas/FasL在人早孕绒毛中的表达情况以及诊断超声照射后对Fas/FasL的表达影响，以确定诊断超声在早孕期的安全使用范围。
资料与方法
观察对象及实验分组：选择拟进行人工流产的早孕妇女24例，孕龄45～60d，平均48d，随即分为4组：对照组为空白照射组、10min组、20min组、30min组。
孕妇及其爱人平素体检，近期无急慢性病史，无毒物及放射性物质接触史，近半年内无避孕药服药史，无畸形儿分娩史及自然流产史。使用Hp8500型彩色多普勒超声诊断仪，探头频率7.5MHz，超声输出功率6.8mW，空间平均时间平均声强(Isata)为3.4mW/cm2 (该声学参数由山西省计量测试研究所使用C-1型毫瓦级超声功率计测试)。采用常规经腹壁照射法，探到孕囊后，测量孕囊到探头的距离，根据分组不同，分别进行不同时间的固定持续照射，超声照射后24h行人工流产，取绒毛组织置于10%福尔马林溶液中固定，常规石蜡包埋、切片(4μm)，将切片捞于预先涂有粘片剂的载玻片上，57℃烤箱烘干30min。
Fas/FasL蛋白表达的检测：Fas/FasL多克隆抗体由美国Santa CruzBiotechnology公司生产；免疫组化染色的过氧化物酶标记选用链霉卵白素SP试剂盒购自北京中山生物技术公司。操作步骤按试剂盒说明书进行。阴性对照组以磷酸盐缓冲液(PBS)取代Fas/FasL抗体。光学显微镜下观察阳性细胞并计数，每张切片选取5个高倍视野(400x)，计数500个细胞求得阳性百分率。
统计学分析：所有数据以
±s表示；各辐照组间以及辐照组与对照组间阳性细胞比较采用t检验。
结 果
早孕绒毛滋养层及其间质细胞在正常发育过程中同时表达Fas/FasL蛋白，但在滋养层FasL蛋白的表达率高于Fas蛋白，在间质细胞中两种蛋白的表达率基本一致，诊断超声照射10min后，两种蛋白的表达与对照组无差异(P>0.05)(见图1)；照射20min和30min后两种蛋白在滋养层和间质层的表达均增高，其表达率显著大于对照组和10min组(P<0.001)(见图2)，各组测值及比较见表1和表2。
表1 超声照射早孕绒毛后Fas蛋白表达率检测及比较(±s)
| 组 别 | 滋养层Fas蛋白 表达率(%) | 间质层Fas蛋白 表达率(%) |
| 对照组(n＝6) | 32.56±5.23 | 30.75±5.41 |
| 10min组(n＝6) | 31.75±5.84 | 31.26±6.02 |
| 20min组(n＝6) | 41.39±6.96* | 36.37±8.78* |
| 30min组(n＝6) | 45.63±9.38*Δ | 38.09±9.12* |
Δ与20min组相比差异有显著性(P<0.001)
表2 超声照射早孕绒毛后FasL蛋白表达率检测及比较(±s)
| 组 别 | 滋养层FasL蛋白 表达率(%) | 间质层FasL蛋白 表达率(%) |
| 对照组(n＝6) | 46.44±4.39 | 31.38±6.33 |
| 10min组(n＝6) | 47.10±5.83 | 32.09±7.35 |
| 20min组(n＝6) | 52.32±6.31* | 47.96±9.74* |
| 30min组(n＝6) | 54.05±8.67* | 49.01±8.87* |
讨 论
Fas/FasL系统被认为是形成和维持免疫特性的重要成分之一。业已探测到FasL表达于侵入母体子宫组织的胎儿滋养层细胞，Fas存在于蜕膜白细胞〔1〕 。Western分析也证实FasL表达于胎盘绒毛和人早孕期的滋养层细胞系，而Fas定位于母体蜕膜的CD45(白细胞共同抗原)阳性细胞〔2〕 。免疫组化和免疫荧光双染证实在胎盘的绒毛部分，FasL主要定位于没有进入母体血流的滋养层细胞，而在滋养层侵入子宫组织，间质滋养层细胞与母体白细胞密切相关，显示了很强的FasL信号，但无Fas染色信号显示〔3〕 。本实验结果显示人早孕期绒毛滋养层及其间质同时表达Fas蛋白和FasL蛋白，其表达率在滋养层分别为(32.56±5.23)%和(30.75±5.41)%，在绒毛间质分别为(46.44±4.39)%和(31.38±6.33)%。RunicR等人的研究发现妊娠23～30周、31～36周、37～42周的羊膜上皮、绒毛膜滋养层和蜕膜细胞层均有一定比例的细胞凋亡，且绒毛膜滋养层(P<0.05)和蜕膜细胞层(P<0.01)的凋亡指数在37～42周组显著大于23～30周组，相反羊膜上皮细胞层的凋亡指数是23～30周组显著大于31～36周组(P<0.05)，提示羊膜上皮、绒毛膜滋养层和蜕膜细胞层的细胞凋亡可能是独立调节〔4〕 。由于Fas系统在多种细胞凋亡中起调节作用，FasL与Fas结合引起表达Fas的细胞凋亡〔5-7〕 ，所以又研究了人类胎膜的Fas表达情况，对胎膜进行免疫组化染色，发现羊膜上皮、绒毛滋养层和蜕膜细胞层均有Fas表达，提示凋亡和Fas信号可能在整个妊娠期间重新定型胎膜构造中起重要作用〔4〕 。
图1 对照组早孕绒毛滋养层及其间质细胞有一定比例的Fas蛋白表达，免疫组化染色(100×)
图2 诊断超声照射后早孕绒毛滋养层及其间质细胞Fas蛋白表达率增加，免疫组化染色(100×)
诊断超声照射早孕妊囊10min未发现滋养层Fas/FasL蛋白表达增加，但持续时间大于10min则表达率呈上升趋势，20min组和30min组均大于对照组和10min组，提示超声持续照射大于10min可引起滋养层细胞的免疫组织化学反应，从而通过Fas系统途径诱导滋养层细胞凋亡增加，说明超声的生物效应可能与Fas系统和细胞凋亡之间有某种内在联系，确切机理尚待进一步探讨。
参考文献
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(2000-03-10 收稿,220天刊出) , 百拇医药