胆囊收缩素受体在胰腺癌细胞中的表达及胆囊收缩素对胰腺癌细胞周期的影响
石建群,周国雄,张弘, 黄介飞, 魏群,南通大学附属医院消化内科 江苏省南通市 226001
曹亮, 通州市第一人民医院 江苏省南通市 226001
通讯作者:周国雄,226001, 江苏省南通市,南通大学附属医院消化内科. zhouguoxiong@pub.nt.jsinfo.net
电话: 0513-5777166 传真:0513-5519820
收稿日期:2005-04-04 接受日期:2005-04-09
摘要
, 百拇医药
目的:观察胆囊收缩素受体(CCKR)在人胰腺癌细胞株SW1990中的表达及胆囊收缩素(CCK)-8肽对胰腺癌细胞周期的影响.
方法:应用RT-PCR方法检测人胰腺癌细胞株SW1990中胆囊收缩素受体(CCKR)mRNA的表达，细胞化学法检测SW1990细胞中胆囊收缩素受体(CCKR)蛋白水平的表达，流式细胞仪检测不同浓度的CCK-8肽对SW199细胞周期的影响.
结果:在人胰腺癌细胞株SW1990中不表达CCK-A亚型受体，但表达CCK-B亚型受体;CCKR在癌细胞株SW1990中的表达主要位于细胞膜上，细胞浆内也可见.在10-8g/L-10-5g/L浓度范围内，CCK-8肽促进SW1990细胞的增殖，呈剂量依赖性，细胞周期分析发现S期细胞增加，G2/M期细胞减少.
, 百拇医药
结论:CCKB受体在人胰腺癌细胞株SW1990中表达，CCK-8肽能促进SW1990细胞的增殖，抑制细胞的凋亡，CCK通过CCKR在胰腺癌细胞的增殖中发挥重要作用.
石建群,周国雄, 张弘,黄介飞,曹亮, 魏群.胆囊收缩素受体在胰腺癌细胞中的表达及胆囊收缩素对胰腺癌细胞周期的影响.世界华人消化杂志 2005;13(13):1599-16021 胰腺癌细胞SW1990CCKB受体免疫细胞化学染色(×250).
2.2RT-PCR检测结果 人胰腺癌细胞株SW1990总RNA经RT-PCR成功扩增出CCK-B受体的基因片段和内参b-actin基因片断，相应的片段大小为CCK-B受体为252 bp，b-actin为486bp，所检出基因片段与原设计完全一致，但未能扩增出CCK-A受体的基因片断(图2).
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图2 (PDF) 人胰腺癌细胞SW1990中CCKR的表达. 1:marker; 2: 正常胰腺组织对照; 3-4: CCK-A受体; 5-6: CCK-B受体.
2.3CCK-8肽干预结果 (1)CCK-8肽干预后6h结果:流式细胞仪检测发现，空白对照组细胞各周期比例分别为:G0/G1期85.71%，G2/M期14.28%，S期0.01%.药物干预组(10-5g/L)G0/G1期77.97%，G2/M期20.49%，S期1.54%.在CCK-8肽使用后6 h，SW1990细胞处于静止期(G0/G1期)细胞比例减少，而处于有丝分裂期(G2/M期)及DNA合成活跃期(S期)比例均增加.同时发现随着CCK-8肽浓度的增加，增殖期细胞的比例呈升高趋势.当CCK-8肽浓度为10-5g/L时，增殖期细胞比例已接近最大，CCK-8肽浓度增为10-4g/L时，增殖期细胞比例升高较10-5g/L已不明显.(2)CCK-8肽干预后12 h的结果:流式细胞仪检测发现，空白对照组细胞各周期比例分别为:G0/G1期2.30%，G2/M期97.66%，S期0.04%.CCK-8肽干预组(10-5g/L)G0/G1期1.02%，G2/M期93.97%，S期5.01%.结果证实细胞接种12h后绝大多数都进入有丝分裂期(G2/M期)，两组在该期的比例基本一致.但在CCK-8肽使用后，10-5g/L组提前进入DNA合成活跃期(S期)比例增加(表1).(3)经统计软件WSTATA进行方差分析:G2/M期:各组间F值为31.19，P<0.01，在统计学上有显著性意义.对照组与10-8g/L组差异无显著性(P= 0.16)，而与其他组之间在统计学上有显著性差异(P<0.05);10-5g/L组与各组之间有显著性差异;其他各组间均无统计学意义.S期:各组间F值为124.08，P<0.01，在统计学上有显著性意义.空白对照组与其他各组间有显著性差异(P<0.05);10-8g/L组与其他各组间有显著性差异(P<0.05);10-7g/L组与其他组间有显著性差异;10-6g/L组与其他组间有显著性差异;10-5g/L与10-4g/L组间无显著性差异.
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表1 12 h的CCK-8肽对SW1990细胞周期的影响(mean±SD)
3 讨论
近年来，胆囊收缩素及其受体在胰腺癌发生中的作用日益受到重视.Reubiet al[1]采用放射自显影技术对人类多种肿进行研究发现，在胰腺癌、小细胞肺癌等多种肿瘤中均有CCK-B受体的表达.CapLinet al[2]研究证实在正常胰腺标本中无CCK-B/胃泌素受体、前胃泌素、甘氨酸延伸胃泌素或酰胺胃泌素的表达，但在胰腺癌细胞则显示中度到高度表达:CCK-B/胃泌素受体95%，前胃泌素91%，甘氨酸延伸胃泌素55%，酰胺胃泌素23%.本研究采用RT-PCR法，检测了人胰腺癌细胞株SW1990中CCKR mRNA的表达情况，结果证实在人胰腺癌细胞株SW1990中表达CCK-B受体的mRNA，与Ji et al[3]的结果吻合.采用免疫细胞化学法证实，在人胰腺癌细胞株SW1990中，CCK-B受体也有中度到高度的阳性表达，与DeWeerth et al[4]的结果类似.本研究在mRNA水平及蛋白水平上共同证实在人胰腺癌细胞株SW1990中有CCK-B受体的表达.人胰腺癌细胞株SW1990中CCKR表达表明了CCK-B受体在胰腺癌的发生、发展中起重要作用.
, 百拇医药
多个研究已证实CCK-B受体为细胞膜受体，属于G蛋白偶联受体超家族，能与鸟苷酸可逆性结合，是一种激素受体和信号传导的功能蛋白.本研究通过免疫细胞化学法证实，在人胰腺癌细胞株中，CCK-B受体不仅存在于细胞膜上而且存在于细胞浆内.细胞膜上CCK-B受体的表达强度高于细胞浆，在细胞浆内CCK-B受体分布比较均匀，细胞浆内CCK-B受体的出现可能与CCK-B受体的内在化有关.Tarasovaet al[5]观察到胃泌素在细胞膜表面与CCK-B受体结合后，可通过包涵素依赖机制内吞入胞，在激素释放到细胞内特定区域后，受体通过再循环机制回到细胞膜上，其再循环时间约1h左右.当受体处于跨膜期，细胞膜上和细胞浆内同时可见受体表达.
本研究采用CCK-8肽对人胰腺癌细胞株SW1990进行药物干预试验.通过流式细胞仪检测证实CCK-8肽能促进该细胞株的增殖，在CCK-8肽作用6 h后即可检测到人胰腺癌细胞株SW1990有部分细胞已提前进入S期.有关CCK促进细胞增殖的机制，目前认为与CCK通过CCKR激活细胞增殖信号转导途径有关.CCK与受体结合后可激活肌醇磷脂信使系统，通过G蛋白激活磷脂酶C而使磷脂酰肌醇二磷酸水解，有1，4，5-三磷酸肌醇和二酰基甘油，并进一步激活蛋白激酶C，从而使胞内多种底物蛋白磷酸化，而激活与基因表达有关的激酶，最终引起丝裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase，MAPK)的激活，直接导致核内转录因子活化而达到调节增殖的作用;转录因子NF-kB也可将活化信号由细胞浆传至细胞核.
, 百拇医药
尽管不同浓度CCK-8肽都对人胰腺癌细胞株SW1990的增殖(增殖)周期有影响，但本研究结果仍表明当CCK-8肽浓度为10-5g/L左右时，促进细胞增殖的作用最大，同时抑制细胞凋亡作用也较明显.实验结果表明，CCK-8肽能促进SW1990细胞提前进入S期，随着CCK-8肽浓度的升高进入S期的SW1990细胞比例也逐渐升高;但当CCK-8肽浓度超过10-5g/L时，增加CCK-8肽的浓度并不明显增加进入S期细胞比例.因此，CCK-8肽浓度为10-5g/L是人胰腺癌细胞株SW1990增殖的一个较佳浓度，同时也提示一定浓度的CCK在人胰腺癌的发生、发展中起重要作用.
实验中CCK-8肽对人胰腺癌细胞株SW1990的增殖存在一个较佳的浓度，这与人胰腺癌细胞株仅为单因素CCK-8肽作用有关.尽管对正常人体内CCK的作用规律目前知之不深，但由于人体内存在着多种细胞生长因子和细胞生长抑制因子，调控肿瘤细胞增殖的因素更加复杂，机制更加多样，多种因素作用的结果或许对所需的CCK浓度不会太高.本研究表明，不仅CCK-8肽的作用浓度对SW1990的增殖和凋亡均有影响，而且CCK-8肽的作用时间也对细胞的增殖和凋亡有影响.在6 h的10-5g/L浓度下，SW1990提前进入S期的比例已超过12 h的对照组(1.54% vs 0.075%);而该浓度12 h S期细胞的比例也比6h的明显升高(5% vs 1.54%).表明在10-8-10-5g/L浓度范围内，CCK-8肽作用时间越长，进入增生期的细胞比例越多.因而提示CCK的浓度及作用时间在促进胰腺癌的发生、发展中均起重要作用.尽管CCK-8肽24 h内的作用结果表明，药物浓度能影响SW1990细胞的增殖和细胞凋亡，但对24h后的CCK-8肽的作用结果，还有待于进一步研究.
, http://www.100md.com
胰腺癌的早期发现、早期诊断和治疗是提高患者生存率的主要策略.尽管目前对胰腺癌采用较多的诊断及治疗方法，但实际效果仍不如人意，深入了解CCK及其受体和其他因素在胰腺癌中的作用，可以筛选出合理有效的胰腺癌生物学标记及药物，更好的用于临床诊断和治疗.
4 参考文献
1 Reubi JC, Scheer JC, Waser B. Cholecystokinin (CCK)-A and CCK-B/gastrinreceptors in human tumors. Cancer
Res 1997;57:1377-1386
2 Caplin M, Savage K, Khan K, Brett B, Rode J, Varro A, Dhillon A.Expression and processing of gastrin in
, 百拇医药
pancreaticadenocarcinoma. Br J Surg 2000;87:1035-1040
3 Ji B, Bi Y, Simeone D, Mortensen RM, Logsdon CD. Human pancreaticacinar cells do not respond to
cholecystokinin.Pharmacol Toxicol 2002;91:327-332
4 De Weerth A, von Schrenck T, Lohr M, Mirau S, Greten H, Kalthoff H. Human pancreatic cancer cell Lines express
theCCKB receptor. Hepatogastroenterology 1999;46:472-478
5 Tarasova NI, Wank SA, Hudson EA, Romanov VI, Czerwinski G, Resau JH,Michejda CJ. Endocytosis of gastrin in
cancercells ex-pression gastrin/CCK-B receptor. Cell Tissue Res 1997;287:325-333
编辑 王谨晖 审读 张海宁, 百拇医药( 石建群, 周国雄, 张 弘, 黄介飞, 曹 亮, 魏 群)
曹亮, 通州市第一人民医院 江苏省南通市 226001
通讯作者:周国雄,226001, 江苏省南通市,南通大学附属医院消化内科. zhouguoxiong@pub.nt.jsinfo.net
电话: 0513-5777166 传真:0513-5519820
收稿日期:2005-04-04 接受日期:2005-04-09
摘要
, 百拇医药
目的:观察胆囊收缩素受体(CCKR)在人胰腺癌细胞株SW1990中的表达及胆囊收缩素(CCK)-8肽对胰腺癌细胞周期的影响.
方法:应用RT-PCR方法检测人胰腺癌细胞株SW1990中胆囊收缩素受体(CCKR)mRNA的表达，细胞化学法检测SW1990细胞中胆囊收缩素受体(CCKR)蛋白水平的表达，流式细胞仪检测不同浓度的CCK-8肽对SW199细胞周期的影响.
结果:在人胰腺癌细胞株SW1990中不表达CCK-A亚型受体，但表达CCK-B亚型受体;CCKR在癌细胞株SW1990中的表达主要位于细胞膜上，细胞浆内也可见.在10-8g/L-10-5g/L浓度范围内，CCK-8肽促进SW1990细胞的增殖，呈剂量依赖性，细胞周期分析发现S期细胞增加，G2/M期细胞减少.
, 百拇医药
结论:CCKB受体在人胰腺癌细胞株SW1990中表达，CCK-8肽能促进SW1990细胞的增殖，抑制细胞的凋亡，CCK通过CCKR在胰腺癌细胞的增殖中发挥重要作用.
石建群,周国雄, 张弘,黄介飞,曹亮, 魏群.胆囊收缩素受体在胰腺癌细胞中的表达及胆囊收缩素对胰腺癌细胞周期的影响.世界华人消化杂志 2005;13(13):1599-16021 胰腺癌细胞SW1990CCKB受体免疫细胞化学染色(×250).
2.2RT-PCR检测结果 人胰腺癌细胞株SW1990总RNA经RT-PCR成功扩增出CCK-B受体的基因片段和内参b-actin基因片断，相应的片段大小为CCK-B受体为252 bp，b-actin为486bp，所检出基因片段与原设计完全一致，但未能扩增出CCK-A受体的基因片断(图2).
, http://www.100md.com
图2 (PDF) 人胰腺癌细胞SW1990中CCKR的表达. 1:marker; 2: 正常胰腺组织对照; 3-4: CCK-A受体; 5-6: CCK-B受体.
2.3CCK-8肽干预结果 (1)CCK-8肽干预后6h结果:流式细胞仪检测发现，空白对照组细胞各周期比例分别为:G0/G1期85.71%，G2/M期14.28%，S期0.01%.药物干预组(10-5g/L)G0/G1期77.97%，G2/M期20.49%，S期1.54%.在CCK-8肽使用后6 h，SW1990细胞处于静止期(G0/G1期)细胞比例减少，而处于有丝分裂期(G2/M期)及DNA合成活跃期(S期)比例均增加.同时发现随着CCK-8肽浓度的增加，增殖期细胞的比例呈升高趋势.当CCK-8肽浓度为10-5g/L时，增殖期细胞比例已接近最大，CCK-8肽浓度增为10-4g/L时，增殖期细胞比例升高较10-5g/L已不明显.(2)CCK-8肽干预后12 h的结果:流式细胞仪检测发现，空白对照组细胞各周期比例分别为:G0/G1期2.30%，G2/M期97.66%，S期0.04%.CCK-8肽干预组(10-5g/L)G0/G1期1.02%，G2/M期93.97%，S期5.01%.结果证实细胞接种12h后绝大多数都进入有丝分裂期(G2/M期)，两组在该期的比例基本一致.但在CCK-8肽使用后，10-5g/L组提前进入DNA合成活跃期(S期)比例增加(表1).(3)经统计软件WSTATA进行方差分析:G2/M期:各组间F值为31.19，P<0.01，在统计学上有显著性意义.对照组与10-8g/L组差异无显著性(P= 0.16)，而与其他组之间在统计学上有显著性差异(P<0.05);10-5g/L组与各组之间有显著性差异;其他各组间均无统计学意义.S期:各组间F值为124.08，P<0.01，在统计学上有显著性意义.空白对照组与其他各组间有显著性差异(P<0.05);10-8g/L组与其他各组间有显著性差异(P<0.05);10-7g/L组与其他组间有显著性差异;10-6g/L组与其他组间有显著性差异;10-5g/L与10-4g/L组间无显著性差异.
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表1 12 h的CCK-8肽对SW1990细胞周期的影响(mean±SD)
细胞周期 | 空白对照 | 10-8 g/L | 10-7 g/L | 10-6 g/L | 10-5 g/L | , http://www.100md.com 10-4 g/L |
G2/M | 97.57±0.12 | 96.46±0.38 | 95.71±0.56 | 95.15±0.14 | 93.85±0.18 | 95.38±0.33 |
| S | 0.075±0.02 | 1.285±0.35 | 2.430±0.41 | 3.525±0.21 | 5.015±0.17 | 4.280±0.85 |
3 讨论
近年来，胆囊收缩素及其受体在胰腺癌发生中的作用日益受到重视.Reubiet al[1]采用放射自显影技术对人类多种肿进行研究发现，在胰腺癌、小细胞肺癌等多种肿瘤中均有CCK-B受体的表达.CapLinet al[2]研究证实在正常胰腺标本中无CCK-B/胃泌素受体、前胃泌素、甘氨酸延伸胃泌素或酰胺胃泌素的表达，但在胰腺癌细胞则显示中度到高度表达:CCK-B/胃泌素受体95%，前胃泌素91%，甘氨酸延伸胃泌素55%，酰胺胃泌素23%.本研究采用RT-PCR法，检测了人胰腺癌细胞株SW1990中CCKR mRNA的表达情况，结果证实在人胰腺癌细胞株SW1990中表达CCK-B受体的mRNA，与Ji et al[3]的结果吻合.采用免疫细胞化学法证实，在人胰腺癌细胞株SW1990中，CCK-B受体也有中度到高度的阳性表达，与DeWeerth et al[4]的结果类似.本研究在mRNA水平及蛋白水平上共同证实在人胰腺癌细胞株SW1990中有CCK-B受体的表达.人胰腺癌细胞株SW1990中CCKR表达表明了CCK-B受体在胰腺癌的发生、发展中起重要作用.
, 百拇医药
多个研究已证实CCK-B受体为细胞膜受体，属于G蛋白偶联受体超家族，能与鸟苷酸可逆性结合，是一种激素受体和信号传导的功能蛋白.本研究通过免疫细胞化学法证实，在人胰腺癌细胞株中，CCK-B受体不仅存在于细胞膜上而且存在于细胞浆内.细胞膜上CCK-B受体的表达强度高于细胞浆，在细胞浆内CCK-B受体分布比较均匀，细胞浆内CCK-B受体的出现可能与CCK-B受体的内在化有关.Tarasovaet al[5]观察到胃泌素在细胞膜表面与CCK-B受体结合后，可通过包涵素依赖机制内吞入胞，在激素释放到细胞内特定区域后，受体通过再循环机制回到细胞膜上，其再循环时间约1h左右.当受体处于跨膜期，细胞膜上和细胞浆内同时可见受体表达.
本研究采用CCK-8肽对人胰腺癌细胞株SW1990进行药物干预试验.通过流式细胞仪检测证实CCK-8肽能促进该细胞株的增殖，在CCK-8肽作用6 h后即可检测到人胰腺癌细胞株SW1990有部分细胞已提前进入S期.有关CCK促进细胞增殖的机制，目前认为与CCK通过CCKR激活细胞增殖信号转导途径有关.CCK与受体结合后可激活肌醇磷脂信使系统，通过G蛋白激活磷脂酶C而使磷脂酰肌醇二磷酸水解，有1，4，5-三磷酸肌醇和二酰基甘油，并进一步激活蛋白激酶C，从而使胞内多种底物蛋白磷酸化，而激活与基因表达有关的激酶，最终引起丝裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase，MAPK)的激活，直接导致核内转录因子活化而达到调节增殖的作用;转录因子NF-kB也可将活化信号由细胞浆传至细胞核.
, 百拇医药
尽管不同浓度CCK-8肽都对人胰腺癌细胞株SW1990的增殖(增殖)周期有影响，但本研究结果仍表明当CCK-8肽浓度为10-5g/L左右时，促进细胞增殖的作用最大，同时抑制细胞凋亡作用也较明显.实验结果表明，CCK-8肽能促进SW1990细胞提前进入S期，随着CCK-8肽浓度的升高进入S期的SW1990细胞比例也逐渐升高;但当CCK-8肽浓度超过10-5g/L时，增加CCK-8肽的浓度并不明显增加进入S期细胞比例.因此，CCK-8肽浓度为10-5g/L是人胰腺癌细胞株SW1990增殖的一个较佳浓度，同时也提示一定浓度的CCK在人胰腺癌的发生、发展中起重要作用.
实验中CCK-8肽对人胰腺癌细胞株SW1990的增殖存在一个较佳的浓度，这与人胰腺癌细胞株仅为单因素CCK-8肽作用有关.尽管对正常人体内CCK的作用规律目前知之不深，但由于人体内存在着多种细胞生长因子和细胞生长抑制因子，调控肿瘤细胞增殖的因素更加复杂，机制更加多样，多种因素作用的结果或许对所需的CCK浓度不会太高.本研究表明，不仅CCK-8肽的作用浓度对SW1990的增殖和凋亡均有影响，而且CCK-8肽的作用时间也对细胞的增殖和凋亡有影响.在6 h的10-5g/L浓度下，SW1990提前进入S期的比例已超过12 h的对照组(1.54% vs 0.075%);而该浓度12 h S期细胞的比例也比6h的明显升高(5% vs 1.54%).表明在10-8-10-5g/L浓度范围内，CCK-8肽作用时间越长，进入增生期的细胞比例越多.因而提示CCK的浓度及作用时间在促进胰腺癌的发生、发展中均起重要作用.尽管CCK-8肽24 h内的作用结果表明，药物浓度能影响SW1990细胞的增殖和细胞凋亡，但对24h后的CCK-8肽的作用结果，还有待于进一步研究.
, http://www.100md.com
胰腺癌的早期发现、早期诊断和治疗是提高患者生存率的主要策略.尽管目前对胰腺癌采用较多的诊断及治疗方法，但实际效果仍不如人意，深入了解CCK及其受体和其他因素在胰腺癌中的作用，可以筛选出合理有效的胰腺癌生物学标记及药物，更好的用于临床诊断和治疗.
4 参考文献
1 Reubi JC, Scheer JC, Waser B. Cholecystokinin (CCK)-A and CCK-B/gastrinreceptors in human tumors. Cancer
Res 1997;57:1377-1386
2 Caplin M, Savage K, Khan K, Brett B, Rode J, Varro A, Dhillon A.Expression and processing of gastrin in
, 百拇医药
pancreaticadenocarcinoma. Br J Surg 2000;87:1035-1040
3 Ji B, Bi Y, Simeone D, Mortensen RM, Logsdon CD. Human pancreaticacinar cells do not respond to
cholecystokinin.Pharmacol Toxicol 2002;91:327-332
4 De Weerth A, von Schrenck T, Lohr M, Mirau S, Greten H, Kalthoff H. Human pancreatic cancer cell Lines express
theCCKB receptor. Hepatogastroenterology 1999;46:472-478
5 Tarasova NI, Wank SA, Hudson EA, Romanov VI, Czerwinski G, Resau JH,Michejda CJ. Endocytosis of gastrin in
cancercells ex-pression gastrin/CCK-B receptor. Cell Tissue Res 1997;287:325-333
编辑 王谨晖 审读 张海宁, 百拇医药( 石建群, 周国雄, 张 弘, 黄介飞, 曹 亮, 魏 群)
