当前位置: 首页 > 期刊 > 《世界华人消化杂志》 > 2005年第14期 > 正文
编号:10924533
乳杆菌细胞壁表面黏附相关蛋白的提取和鉴定
http://www.100md.com 王 斌, 魏 泓
王斌,魏泓,通讯作者,:,摘要,目的,方法,结果,结论,1(PDF)罗伊氏乳杆菌JCM1081细胞壁表面蛋白的,SDS-PAGE.,图,2(PDF)采用H
第1页

    参见附件(896KB,4页)。

     王斌, 魏泓,中国人民解放军第三军医大学基础医学部实验动物学教研室 重庆市 400038

    通讯作者:魏泓,400038, 重庆市, 中国人民解放军第三军医大学基础医学部实验动物学教研室. weihong@mail.tmmu.com.cn

    电话: 023-68752051 传真:023-68752051

    收稿日期:2005-05-28 接受日期:2005-06-08

    摘要

    目的:提取和鉴定参与乳杆菌黏附肠上皮样细胞以及粘蛋白受体的细胞壁表面蛋白.

    方法:采用HRP标记的粘蛋白受体以及NHS-Biotin标记的HT-29细胞与提取的乳杆菌JCM1081的细胞壁表面蛋白进行蛋白印迹,对参与黏附的细胞壁表面蛋白进行初步鉴定.

    结果:Western blot 结果显示Mr29 000和Mr14 000的两种细胞壁表面蛋白在与粘蛋白受体和HT-29细胞的杂交中都出现了强阳性.

    结论:存在于乳杆菌JCM1081细胞壁表面的Mr29 000和Mr14 000的两种蛋白能够特异性识别粘蛋白受体和细胞膜受体,并与之结合,为乳杆菌JCM1081的黏附相关蛋白.

    王斌,魏泓. 乳杆菌细胞壁表面黏附相关蛋白的提取和鉴定.世界华人消化杂志 2005;13(14):1762-17661 (PDF)罗伊氏乳杆菌JCM1081细胞壁表面蛋白的SDS-PAGE.泳道1,2:采用溶菌酶和氯化锂提取的JCM1081细胞壁表面蛋白;泳道3:采用溶菌酶和变溶菌素提取的JCM1081细胞壁表面蛋白;4: 分子量标准; 泳道5:预染的分子量标准.

    2 (PDF)采用HRP标记的粘蛋白与罗伊氏乳杆菌细胞壁表面蛋白的Westernblot. 泳道1: 采用溶菌酶和氯化锂提取的JCM1081细胞壁表面蛋白与HRP标记的粘蛋白杂交,产生了Mr29 000、Mr26 000和Mr14 000三条阳性带; 泳道2:采用溶菌酶和变溶菌素提取的JCM1081细胞壁表面蛋白与HRP标记的粘蛋白杂交,产生了Mr29 000和Mr14 000二条阳性带; 泳道3:阴性对照; 泳道4: 预染的分子量标准.

    2.2乳杆菌细胞壁表面与HT-29细胞黏附的黏附相关蛋白鉴定将两种方法提取的细胞壁表面蛋白进行SDS-PAGE,并将蛋白转移至PVDF膜上,然后与NHS-biotin标记的HT-29细胞杂交,结果表明,利用两种方法提取得到的细胞壁表面蛋白中出现了两条阳性条带,分别为:Mr29 000和Mr14 000,而作为阴性对照的牛血清白蛋白(BSA)并未出现杂交条带,表明Mr29 000和Mr14 000这两种细胞壁表面蛋白可以特异性识别HT-29细胞膜表面的黏附素受体,并与之结合(图3).

    为了进一步证实乳杆菌与细胞黏附的胞壁表面蛋白,将上述利用两种方法提取得到的细胞壁表面蛋白与HT-29细胞进行共孵育后,通过漂洗以除去未黏附的蛋白,然后将细胞刮下来,用0.1mol/L盐酸-甘氨酸缓冲液(pH3.0)进行洗脱,洗脱下来的蛋白透析后进行了SDS-PAGE,并将蛋白转移至PVDF膜上,与JCM1081的多克隆抗体杂交,从Westernblot图谱上可以看出,洗脱下来的蛋白中杂交产生了一条阳性条带,Mr29 000(图4),而加入相应缓冲液(无细胞壁表面蛋白)的阴性对照中未出现阳性条带.

    3 (PDF)采用NHS-Biotin标记的HT-29细胞与罗伊氏乳杆菌细胞壁表面蛋白的Westernblot. 泳道1:采用溶菌酶和氯化锂提取的JCM1081细胞壁表面蛋白与NHS-Biotin标记的HT-29细胞杂交,产生了Mr29 000和Mr14 000二条阳性带; 泳道2:阴性对照;泳道3:采用溶菌酶和变溶菌素提取的JCM1081细胞壁表面蛋白与NHS-Biotin标记的HT-29细胞杂交,产生了Mr29 000和Mr14 000二条阳性带.

    4 (PDF)采用JCM1081的多克隆抗体与罗伊氏乳杆菌细胞壁表面蛋白的Westernblot. 泳道1: 采用溶菌酶和氯化锂提取的JCM1081细胞壁表面蛋白与JCM1081的多克隆抗体杂交,产生了Mr29 000阳性带;泳道2: 采用溶菌酶和变溶菌素提取的JCM1081细胞壁表面蛋白与JCM1081的多克隆抗体杂交,产生了Mr29 000阳性带;泳道3: 预染的分子量标准.

    3 讨论

    黏液粘蛋白是广泛分布在胃肠道黏膜表面的一种糖蛋白,由杯状细胞分泌产生,存在于肠上皮细胞表面形成一层黏液胶层,保护细胞免受肠道致病菌的损伤.由于这种黏液层为肠道内的生理性有益菌和潜在的致病菌提供了生态位,进入肠道内的微生物定植于此,随着肠蠕动和黏液流动而被排除,以阻止细菌进一步与上皮细胞接触.因此,黏液粘蛋白为进入肠道内的细菌黏附、定植提供了受体位点[9].有学者[10-12]曾通过提取和纯化肠黏液粘蛋白,作为黏附素受体来检测益生菌与粘蛋白的黏附状况,Rojaset al[8,13]以提纯的小肠粘蛋白作为受体,用HRP标记后与发酵乳杆菌104R的菌体表面蛋白进行Westernblot,成功鉴定了菌体表面蛋白中参与黏附的黏附素蛋白.

    为了探讨乳杆菌JCM1081细胞壁表面蛋白在黏附过程中的作用,我们采用不同的方法提取了乳杆菌JCM1081的细胞壁表面蛋白,进行SDS-PAGE后分别与HRP标记的粘蛋白受体和NHS-Biotin标记的HT-29进行杂交,Westernblot 结果显示,在乳杆菌JCM1081细胞壁表面蛋白中,Mr29 000和Mr14 000的两种蛋白在与粘蛋白和细胞的杂交中都出现了强阳性,表明这两种蛋白都能够特异性与粘蛋白受体和HT-29细胞结合,提示这两种蛋白可能参与了乳杆菌JCM1081与粘蛋白以及细胞的黏附.尤其对于与细胞的黏附,由于细胞膜表面分布有细菌黏附素的特异性受体 ......

您现在查看是摘要介绍页,详见PDF附件(896KB,4页)