乳杆菌细胞壁表面黏附相关蛋白的提取和鉴定

http://www.100md.com 王 斌, 魏 泓

王斌,魏泓,通讯作者,:,摘要,目的,方法,结果,结论,1(PDF)罗伊氏乳杆菌JCM1081细胞壁表面蛋白的,SDS-PAGE.,图,2(PDF)采用H

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    参见附件(896KB，4页)。

     王斌, 魏泓,中国人民解放军第三军医大学基础医学部实验动物学教研室 重庆市 400038

    通讯作者:魏泓,400038, 重庆市, 中国人民解放军第三军医大学基础医学部实验动物学教研室. weihong@mail.tmmu.com.cn

    电话: 023-68752051 传真:023-68752051

    收稿日期:2005-05-28 接受日期:2005-06-08

    摘要

    目的:提取和鉴定参与乳杆菌黏附肠上皮样细胞以及粘蛋白受体的细胞壁表面蛋白.

    方法:采用HRP标记的粘蛋白受体以及NHS-Biotin标记的HT-29细胞与提取的乳杆菌JCM1081的细胞壁表面蛋白进行蛋白印迹，对参与黏附的细胞壁表面蛋白进行初步鉴定.

    结果:Western blot 结果显示M_r29 000和M_r14 000的两种细胞壁表面蛋白在与粘蛋白受体和HT-29细胞的杂交中都出现了强阳性.

    结论:存在于乳杆菌JCM1081细胞壁表面的M_r29 000和M_r14 000的两种蛋白能够特异性识别粘蛋白受体和细胞膜受体，并与之结合，为乳杆菌JCM1081的黏附相关蛋白.

    王斌,魏泓. 乳杆菌细胞壁表面黏附相关蛋白的提取和鉴定.世界华人消化杂志 2005;13(14):1762-17661 (PDF)罗伊氏乳杆菌JCM1081细胞壁表面蛋白的SDS-PAGE.泳道1，2:采用溶菌酶和氯化锂提取的JCM1081细胞壁表面蛋白;泳道3:采用溶菌酶和变溶菌素提取的JCM1081细胞壁表面蛋白;4: 分子量标准; 泳道5:预染的分子量标准.

    图2 (PDF)采用HRP标记的粘蛋白与罗伊氏乳杆菌细胞壁表面蛋白的Westernblot. 泳道1: 采用溶菌酶和氯化锂提取的JCM1081细胞壁表面蛋白与HRP标记的粘蛋白杂交，产生了M_r29 000、M_r26 000和M_r14 000三条阳性带; 泳道2:采用溶菌酶和变溶菌素提取的JCM1081细胞壁表面蛋白与HRP标记的粘蛋白杂交，产生了M_r29 000和M_r14 000二条阳性带; 泳道3:阴性对照; 泳道4: 预染的分子量标准.

    2.2乳杆菌细胞壁表面与HT-29细胞黏附的黏附相关蛋白鉴定将两种方法提取的细胞壁表面蛋白进行SDS-PAGE，并将蛋白转移至PVDF膜上，然后与NHS-biotin标记的HT-29细胞杂交，结果表明，利用两种方法提取得到的细胞壁表面蛋白中出现了两条阳性条带，分别为:M_r29 000和M_r14 000，而作为阴性对照的牛血清白蛋白(BSA)并未出现杂交条带，表明M_r29 000和M_r14 000这两种细胞壁表面蛋白可以特异性识别HT-29细胞膜表面的黏附素受体，并与之结合(图3).

    为了进一步证实乳杆菌与细胞黏附的胞壁表面蛋白，将上述利用两种方法提取得到的细胞壁表面蛋白与HT-29细胞进行共孵育后，通过漂洗以除去未黏附的蛋白，然后将细胞刮下来，用0.1mol/L盐酸-甘氨酸缓冲液(pH3.0)进行洗脱，洗脱下来的蛋白透析后进行了SDS-PAGE，并将蛋白转移至PVDF膜上，与JCM1081的多克隆抗体杂交，从Westernblot图谱上可以看出，洗脱下来的蛋白中杂交产生了一条阳性条带，M_r29 000(图4)，而加入相应缓冲液(无细胞壁表面蛋白)的阴性对照中未出现阳性条带.

    图3 (PDF)采用NHS-Biotin标记的HT-29细胞与罗伊氏乳杆菌细胞壁表面蛋白的Westernblot ......