RT-PCR法与血凝抑制法鉴定流感病毒的比较
摘要:目的 比较逆转录聚合酶链反应法(RT-PCR)与血凝抑制法在流感病毒鉴定中的优劣，以期建立能快速、特异地从临床标本中检测并鉴定流感病毒的新方法。 方法 用常规细胞培养法增殖病毒后，分别用RT-PCR反应法和常规血凝抑制法进行流感病毒鉴定。 结果 在13份发生细胞病理变化的标本中RT-PCR阳性标本为9份，其中甲型7份(6份甲3亚型、l份甲l亚型)，乙型2份;而用血凝抑制法鉴定阳性标本仅6份。 结论 RT-PCR法快速、特异、灵敏，在流感病毒鉴定中具有较大的应用价值。
关键词:RT-PCR法;血凝抑制法;流感病毒;鉴定
Comparison of RT-PCR and hemagglutination inhibition test in detection of influenza virus.
XIAO Jin-hui，WU Zhen-hong，XIAO Hui-zhen，et al.(Baoan District Center for Disease Control and Prevention of Shenzhen City，Shenzhen518101，Guangdong，P.R.China)
Abstract:Objective To compare the advantage and disadvantage of RT-PCR assay and HI test in the detection of Influenza virus，so as to establish proper method for differentiation of influenza virus from clinical samples. Methods After amplifing the virus by cell culture，influenza virus was differentiated by using RT-PCR and hemagglutin ation inhibition test. Results Out of the13samples which had cytopathologic changes，9positive strains were detected by RT-PCR assay including seven A type(six H3N2subtypes and one H1Nlsubtype)and two B types，but6positive strains were detected by HI test. Conclusion RT-PCR is rapid，specific and sensitive and possesses great value for practical application in the detection of influenza virus.
Key words:RT-PCR assay;Hemagglutimation inhibition test;Influenza virus;Differentiation
流行性感冒是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病，它起病急，蔓延快，对人群尤其是儿童及老年人造成很大的危害。流感病毒分为甲、乙、丙三型，其中变异大、危害重的主要是甲型和乙型流感病毒。诊断流感不仅靠临床表现，还要靠实验室的快速诊断。流感病毒分离方法常采用组织培养及鸡胚分离，而病毒分型及亚型鉴定则采用标准血清进行血凝抑制试验，现研究应用RT-PCR方法从临床标本中快速鉴定流感病毒，比较两种方法的优劣，以期建立快速、特异、有效检测并鉴定流感病毒的新方法。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 狗肾传代细胞(MDCK)，已传8代，由深圳市疾病预防控制中心提供;Hank's应用液购自深圳市诚健雅生物工程公司;细胞维持液由RPMl1640培养液加双抗(青霉素、链霉素各为200mg/ml)、1%先锋霉素，1%谷氨酰胺，2.5%Hepe's，0.0250%的胰酶，7.5%的牛血清白蛋白，用5.5%NaHCO 3 调pH为7.2～7.4;细胞生长液由细胞维持液加10%小牛血清;特异性免疫血清由国家流感中心提供;RT-PCR法试剂中随机引物、逆转录酶、Taq酶、Rnasin(Pmmega)(上海生物工程公司);dNTP(华美公司);型别鉴定引物A、B和亚型鉴定引物H1、H2、Nl和N2，均由基因公司合成 [1] 。各序列如下:A-l(5'd-ATCACTCACTGAGTGACA TC)，A-2(5'd-CCTCCAGTTTTCTTAGGATC)为306bp;B-1(5'd-CGGACAACA TGCTTAGGATC)，B-2(5'd-TCTCTCTTCAAGAGACATGG)为226bp;Hl-1(5'd-GATGCAGACACAATATGTATAGG)，H1-2(5'd-COC-TACAGAGACATA AGCATTT)为611bp;H3-1(5'd-TCAGATTGAAGTGACTAATGCT)，H3-2(5'd-AAT TTTGATGCCTGAAACCA)为976bp;N1-1(5'd-TTGCTTGGTCAGCAAGTGCA)，Nl-2(5'd-TCTGTC CATCCATTAGGATCC)为615bp;N2-l(5'd-ATG-GTCCAGCTC AAGTTCTCA)，N2-2(5'd-TCCAGTTAT-GTGTGCTCAGG)为434bp。
1.2 方法
1.2.1 标本采集和处理 分别于医院儿科采集疑似流感病人(发热38℃以上、流涕、咽痛、咳嗽等症状)的含漱液和咽拭子，冰浴送至实验室，加常规双抗和先锋霉素，4℃冰箱过夜后进行接种。1.2.2 病毒增殖 常规组织培养法 [2] ，狗肾传代细胞(MDCK)培养瓶长成单层后，每管接种0.5m1标本，每标本接种3管，置35℃孵育，每天用倒置显微镜观察细胞病理变化效应(CPE)，当出现CPE时，按常规血凝试验检测细胞维持液中的红细胞凝集活性。
1.2.3 血凝抑制法 [2] 将收获的有红细胞凝集活性的维持液与特异性免疫血清进行血凝抑制实验，通过血凝抑制试验滴度和株间抗原比鉴定病毒型别。
1.2.4 病毒RNA的提取 [3] 病毒株细胞培养液离心沉淀后用SDS、蛋白酶K处理，酚-氯仿抽提，无水乙醇沉淀，焦炭酸二乙酯处理三蒸水溶解，-20℃保存;选取常见各亚型国际代表株B/京防B/184/93(乙型)、A/悉尼/05/97(甲3亚型)、A/深圳/1/99(甲3亚型)、A/桂防/10/94(甲1亚型)同法提取病毒RNA。
1.2.5 cDNA合成 上述方法提取的病毒RNA加入随机引物、逆转录酶37℃1h合成cDNA。
1.2.6 PCR反应 各毒株cDNA分别加入型别引物A-1、A-2和B-1、B-2，Taq酶，MgCl 2 至50μl体系，PCR循环参考Wright等方法 [4] :94℃5min预变性;94℃1min，52℃2min，72℃3min35个循环;72℃延伸10min，产物于3%琼脂糖凝胶电泳后，EB染色，紫外灯下观察，凝胶成像分析系统拍照，分析结果。再取引物A阳性毒株(甲型流感病毒)，分别加亚型引物H1-1、H1-2和H3-1、H3-2及N1-1、N1-2;N2-1、N2-2各100ng，再进行PCR，其余条件同上。
2 结果
2.1 RT-PCR法的特异性 选取各亚型国际代表株提取RNA后，分别以型别引物进行RT-PCR扩增，可见4株毒株中仅B/京防/184/93(乙型)毒株扩增结果有263bp一条带;再将3株甲型毒株分别用4对引物Hl、H3、N1和N2进行RT-PCR，2株甲3型毒株有927bp一条带，而甲1型有613bp一条带。结果显示，各型别、亚型扩增的条带互不干扰(图1)，说明各引物均有较好的特异性，这为本方法的可靠性提供了保证。
2.2 按照常规血凝抑制法鉴定病毒型别，检测到在13份出现细胞病理变化效应的标本中，血凝抑制试验阳性的有6份，其中甲型5份(甲3亚型4份，甲1亚型1份)乙型1份;而用RT-PCR检测出阳性标本为9份，其中甲型7份(甲3亚型6份、1份甲1亚型1份)，乙型2份，符合率分别为66.7%、100.0%、50.0%，具体结果见表1，证明RT-PCR法较血凝抑制试验敏感。
图1 4毒株RT-PCR法鉴定结果
Fig1 Four virus strains differentiated by RT-PCR
1.Marker PBR322/Hinfl;2.A/桂防/10/94毒株用亚型引物得到的613bp条带;3.B/京防B/184/93毒株用型别引物得到的263bp条带;4.4和5分别是A/悉尼/05/97、A/深圳/1/99用亚型引物得到的927bp条带;6.空白对照;7.Marker PBR322/BamⅢ
1.Marker PBR322/Hinfl;2.A/GF/10/94virus strain with613bp;3.B/JFB/184/93virus strain with263bp;4&5.A/Sydney/0505/97/Shenzhen/1/99virus strains with927bp;6.Blank control;7.Marker PBR32/BbamⅢ
表1 RT-PCR法和血凝抑制试验鉴定结果比较(略)
Table1 Comparison of RT-PCRwithHI test in differentiation of virus
3 讨论
3.1 在出现细胞病变效应的标本中RT-PCR和血凝抑制试验阴性样本可能是其他具有血凝素的呼吸道病毒如呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒等，这些病毒所引起的疾病早期症状与流感相似，在采样和鉴定过程中要注意区别。
3.2 流感病毒引起的流行性感冒发病急、传播快、危害大，但Leonardi等报道，快速诊断可使9%～38%的流感被有效地控制 [5] ，所以及时预测和控制流感的流行，建立快速、准确的鉴定和分析流感抗原变异的实验室诊断技术十分重要。近年随着分子生物学的不断发展，许多新的快速检测方法被应用于流感监测中，如免疫电镜、原位杂交PCR、RT-PCR巢式PCR等，在流感病毒监测和抗原性变异分析中正发挥着越来越重要的作用 [6] 。
3.3 采用RT-PCR方法进行流感病毒鉴定，具有以下优点。
3.3.1 传统的鸡胚接种病毒需72h，而本法采用MD-CK细胞培养法平均培养时间仅为42h，这使培养时间大大缩短，而RT-PCR试验也可在数小时内完成，具有快速的优点。
3.3.2 RT-PCR和血凝抑制试验比较，RT-PCR法有9株阳性而血凝抑制试验仅有6株为阳性，说明RT-PCR法具有较高的灵敏度。
3.3.3 PCR试验中，通过针对HA和NA基因节段分别设计了合适的引物，可同时进行型别及亚型的鉴定，同时对于发生重组的毒株也可得到准确的鉴定，避免交叉现象发生;PCR结果显示空白对照无条带，其余各组均有特异条带，各亚型扩增的条带互不干扰，说明RT-PCR结果可靠、特异性好。
RT-PCR法具有所需病毒量小，快速、灵敏、特异、可靠的优点，在流感病毒鉴定中具有较大的应用价值。
参考文献:
[1]石伟先，刘海林.逆转录聚合酶链反应法在北京市流感病毒型别鉴定中的应用[J].中华预防医学杂志，2002，36(6):382～385.
[2]郭元吉，程晓雯.流行性感冒病毒及其实验技术[M].北京:中国三峡出版社，1997，94～96.
[3]Cane PA，Pringle CR.Molecular epidemiology of respiratory syncytial virus:rapid identification of subgroup A lineages[J].J Virol Meth.1992，40:297～306
[4]Wright K，Wilson GA，Novosad D，etal.Typing and subtyping of influenza viruses in clinical samples by PCR[J].J Gin Microbio1.1995，33:1180～1184.
[5] Yu Xinrui，Hua Lisha.Influenza[J].Medical Science in Overseas:SocialMedical Science，2000，17(3):128～131.
[6]李先茜，王成贵，庄丽.流感病毒快速诊断的研究进展[J].北华大学学报(自然科学版)，2003，142～147.
作者单位:深圳市宝安区疾病预防控制中心，广东深圳 518101., 百拇医药(肖锦晖 吴振宏 肖惠贞 张震文 谭雪芳)
关键词:RT-PCR法;血凝抑制法;流感病毒;鉴定
Comparison of RT-PCR and hemagglutination inhibition test in detection of influenza virus.
XIAO Jin-hui，WU Zhen-hong，XIAO Hui-zhen，et al.(Baoan District Center for Disease Control and Prevention of Shenzhen City，Shenzhen518101，Guangdong，P.R.China)
Abstract:Objective To compare the advantage and disadvantage of RT-PCR assay and HI test in the detection of Influenza virus，so as to establish proper method for differentiation of influenza virus from clinical samples. Methods After amplifing the virus by cell culture，influenza virus was differentiated by using RT-PCR and hemagglutin ation inhibition test. Results Out of the13samples which had cytopathologic changes，9positive strains were detected by RT-PCR assay including seven A type(six H3N2subtypes and one H1Nlsubtype)and two B types，but6positive strains were detected by HI test. Conclusion RT-PCR is rapid，specific and sensitive and possesses great value for practical application in the detection of influenza virus.
Key words:RT-PCR assay;Hemagglutimation inhibition test;Influenza virus;Differentiation
流行性感冒是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病，它起病急，蔓延快，对人群尤其是儿童及老年人造成很大的危害。流感病毒分为甲、乙、丙三型，其中变异大、危害重的主要是甲型和乙型流感病毒。诊断流感不仅靠临床表现，还要靠实验室的快速诊断。流感病毒分离方法常采用组织培养及鸡胚分离，而病毒分型及亚型鉴定则采用标准血清进行血凝抑制试验，现研究应用RT-PCR方法从临床标本中快速鉴定流感病毒，比较两种方法的优劣，以期建立快速、特异、有效检测并鉴定流感病毒的新方法。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 狗肾传代细胞(MDCK)，已传8代，由深圳市疾病预防控制中心提供;Hank's应用液购自深圳市诚健雅生物工程公司;细胞维持液由RPMl1640培养液加双抗(青霉素、链霉素各为200mg/ml)、1%先锋霉素，1%谷氨酰胺，2.5%Hepe's，0.0250%的胰酶，7.5%的牛血清白蛋白，用5.5%NaHCO 3 调pH为7.2～7.4;细胞生长液由细胞维持液加10%小牛血清;特异性免疫血清由国家流感中心提供;RT-PCR法试剂中随机引物、逆转录酶、Taq酶、Rnasin(Pmmega)(上海生物工程公司);dNTP(华美公司);型别鉴定引物A、B和亚型鉴定引物H1、H2、Nl和N2，均由基因公司合成 [1] 。各序列如下:A-l(5'd-ATCACTCACTGAGTGACA TC)，A-2(5'd-CCTCCAGTTTTCTTAGGATC)为306bp;B-1(5'd-CGGACAACA TGCTTAGGATC)，B-2(5'd-TCTCTCTTCAAGAGACATGG)为226bp;Hl-1(5'd-GATGCAGACACAATATGTATAGG)，H1-2(5'd-COC-TACAGAGACATA AGCATTT)为611bp;H3-1(5'd-TCAGATTGAAGTGACTAATGCT)，H3-2(5'd-AAT TTTGATGCCTGAAACCA)为976bp;N1-1(5'd-TTGCTTGGTCAGCAAGTGCA)，Nl-2(5'd-TCTGTC CATCCATTAGGATCC)为615bp;N2-l(5'd-ATG-GTCCAGCTC AAGTTCTCA)，N2-2(5'd-TCCAGTTAT-GTGTGCTCAGG)为434bp。
1.2 方法
1.2.1 标本采集和处理 分别于医院儿科采集疑似流感病人(发热38℃以上、流涕、咽痛、咳嗽等症状)的含漱液和咽拭子，冰浴送至实验室，加常规双抗和先锋霉素，4℃冰箱过夜后进行接种。1.2.2 病毒增殖 常规组织培养法 [2] ，狗肾传代细胞(MDCK)培养瓶长成单层后，每管接种0.5m1标本，每标本接种3管，置35℃孵育，每天用倒置显微镜观察细胞病理变化效应(CPE)，当出现CPE时，按常规血凝试验检测细胞维持液中的红细胞凝集活性。
1.2.3 血凝抑制法 [2] 将收获的有红细胞凝集活性的维持液与特异性免疫血清进行血凝抑制实验，通过血凝抑制试验滴度和株间抗原比鉴定病毒型别。
1.2.4 病毒RNA的提取 [3] 病毒株细胞培养液离心沉淀后用SDS、蛋白酶K处理，酚-氯仿抽提，无水乙醇沉淀，焦炭酸二乙酯处理三蒸水溶解，-20℃保存;选取常见各亚型国际代表株B/京防B/184/93(乙型)、A/悉尼/05/97(甲3亚型)、A/深圳/1/99(甲3亚型)、A/桂防/10/94(甲1亚型)同法提取病毒RNA。
1.2.5 cDNA合成 上述方法提取的病毒RNA加入随机引物、逆转录酶37℃1h合成cDNA。
1.2.6 PCR反应 各毒株cDNA分别加入型别引物A-1、A-2和B-1、B-2，Taq酶，MgCl 2 至50μl体系，PCR循环参考Wright等方法 [4] :94℃5min预变性;94℃1min，52℃2min，72℃3min35个循环;72℃延伸10min，产物于3%琼脂糖凝胶电泳后，EB染色，紫外灯下观察，凝胶成像分析系统拍照，分析结果。再取引物A阳性毒株(甲型流感病毒)，分别加亚型引物H1-1、H1-2和H3-1、H3-2及N1-1、N1-2;N2-1、N2-2各100ng，再进行PCR，其余条件同上。
2 结果
2.1 RT-PCR法的特异性 选取各亚型国际代表株提取RNA后，分别以型别引物进行RT-PCR扩增，可见4株毒株中仅B/京防/184/93(乙型)毒株扩增结果有263bp一条带;再将3株甲型毒株分别用4对引物Hl、H3、N1和N2进行RT-PCR，2株甲3型毒株有927bp一条带，而甲1型有613bp一条带。结果显示，各型别、亚型扩增的条带互不干扰(图1)，说明各引物均有较好的特异性，这为本方法的可靠性提供了保证。
2.2 按照常规血凝抑制法鉴定病毒型别，检测到在13份出现细胞病理变化效应的标本中，血凝抑制试验阳性的有6份，其中甲型5份(甲3亚型4份，甲1亚型1份)乙型1份;而用RT-PCR检测出阳性标本为9份，其中甲型7份(甲3亚型6份、1份甲1亚型1份)，乙型2份，符合率分别为66.7%、100.0%、50.0%，具体结果见表1，证明RT-PCR法较血凝抑制试验敏感。
图1 4毒株RT-PCR法鉴定结果
Fig1 Four virus strains differentiated by RT-PCR
1.Marker PBR322/Hinfl;2.A/桂防/10/94毒株用亚型引物得到的613bp条带;3.B/京防B/184/93毒株用型别引物得到的263bp条带;4.4和5分别是A/悉尼/05/97、A/深圳/1/99用亚型引物得到的927bp条带;6.空白对照;7.Marker PBR322/BamⅢ
1.Marker PBR322/Hinfl;2.A/GF/10/94virus strain with613bp;3.B/JFB/184/93virus strain with263bp;4&5.A/Sydney/0505/97/Shenzhen/1/99virus strains with927bp;6.Blank control;7.Marker PBR32/BbamⅢ
表1 RT-PCR法和血凝抑制试验鉴定结果比较(略)
Table1 Comparison of RT-PCRwithHI test in differentiation of virus
3 讨论
3.1 在出现细胞病变效应的标本中RT-PCR和血凝抑制试验阴性样本可能是其他具有血凝素的呼吸道病毒如呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒等，这些病毒所引起的疾病早期症状与流感相似，在采样和鉴定过程中要注意区别。
3.2 流感病毒引起的流行性感冒发病急、传播快、危害大，但Leonardi等报道，快速诊断可使9%～38%的流感被有效地控制 [5] ，所以及时预测和控制流感的流行，建立快速、准确的鉴定和分析流感抗原变异的实验室诊断技术十分重要。近年随着分子生物学的不断发展，许多新的快速检测方法被应用于流感监测中，如免疫电镜、原位杂交PCR、RT-PCR巢式PCR等，在流感病毒监测和抗原性变异分析中正发挥着越来越重要的作用 [6] 。
3.3 采用RT-PCR方法进行流感病毒鉴定，具有以下优点。
3.3.1 传统的鸡胚接种病毒需72h，而本法采用MD-CK细胞培养法平均培养时间仅为42h，这使培养时间大大缩短，而RT-PCR试验也可在数小时内完成，具有快速的优点。
3.3.2 RT-PCR和血凝抑制试验比较，RT-PCR法有9株阳性而血凝抑制试验仅有6株为阳性，说明RT-PCR法具有较高的灵敏度。
3.3.3 PCR试验中，通过针对HA和NA基因节段分别设计了合适的引物，可同时进行型别及亚型的鉴定，同时对于发生重组的毒株也可得到准确的鉴定，避免交叉现象发生;PCR结果显示空白对照无条带，其余各组均有特异条带，各亚型扩增的条带互不干扰，说明RT-PCR结果可靠、特异性好。
RT-PCR法具有所需病毒量小，快速、灵敏、特异、可靠的优点，在流感病毒鉴定中具有较大的应用价值。
参考文献:
[1]石伟先，刘海林.逆转录聚合酶链反应法在北京市流感病毒型别鉴定中的应用[J].中华预防医学杂志，2002，36(6):382～385.
[2]郭元吉，程晓雯.流行性感冒病毒及其实验技术[M].北京:中国三峡出版社，1997，94～96.
[3]Cane PA，Pringle CR.Molecular epidemiology of respiratory syncytial virus:rapid identification of subgroup A lineages[J].J Virol Meth.1992，40:297～306
[4]Wright K，Wilson GA，Novosad D，etal.Typing and subtyping of influenza viruses in clinical samples by PCR[J].J Gin Microbio1.1995，33:1180～1184.
[5] Yu Xinrui，Hua Lisha.Influenza[J].Medical Science in Overseas:SocialMedical Science，2000，17(3):128～131.
[6]李先茜，王成贵，庄丽.流感病毒快速诊断的研究进展[J].北华大学学报(自然科学版)，2003，142～147.
作者单位:深圳市宝安区疾病预防控制中心，广东深圳 518101., 百拇医药(肖锦晖 吴振宏 肖惠贞 张震文 谭雪芳)