褪黑素对链脲佐菌素所致胰岛β细胞损伤的保护作用研究
http://www.100md.com
贾延?. 信照亮. 胡海涛. 任惠民.
β细胞.链脲佐菌素.褪黑素.自由基.一氧化氮.
参见附件(206kb)。
作者：贾延劼 信照亮 胡海涛 任惠民 王唯析
单位：(西安医科大学基础医学院人体解剖学教研室 西安 710061)
关键词：β细胞；链脲佐菌素；褪黑素；自由基；一氧化氮
西安医科大学学报000104 摘要 用链脲佐菌素(STZ)作用于离体胰岛β细胞24 h，一 氧化氮(NO)、脂质过氧化产物丙二醛(MDA)生成增多，胰岛细胞膜流动性下降，微粘度增高 ， 同时胰岛素分泌功能降低，细胞存活率下降。预先给高浓度褪黑素(10μmol/L)处理24h者， 可减少NO、MDA的释放，提高超氧化物歧化酶的水平，使胰岛细胞的氧化损伤减轻，膜微粘 度降低，膜流动性增加，细胞存活率显著提高。但低浓度褪黑素(10nmol/L)无此作用。提示 高浓度褪黑素对STZ所致的胰岛β细胞损伤有一定的保护作用。
中图分类号 R587.102 文献标识码 A
文章编号 0258-0659(2000)01- 0013-03
Melatonin protects β-cell from streptozotocin induced injury
Jia Yanjie, Xin Zhaoliang, Hu Haitao
(Department of Anatomy，Xian Medical University， Xi′an 710061,China)
ABSTRACT In order to investigate the protective effe c t of melatonin on the β-cells injury induced by streptozotocin(STZ).STZ was i njected cells in vitro for 24h.The results showed that STZ was able to significantly increase nitric oxide (NO)and MDA production, redu ce accumulated insulin release and insulin release at glucose stimulation ,decre ase the membrane fluidity and cell viability of islets.After 24h pretreatment wi th 10μmol/L of melationin, it reversed the injury of STZ-treated β-cells by reducing NO and MDA production and enhancing SOD level.Howerver, 10nmol/L of mel atonin had no similar effects.Conclusion:It suggest that melatonin m ay play a protective role in β-cell injury induced by STZ.
KEY WORDS β-cell streptozotocin (STZ) melatonin free radical nitric oxide (NO)
胰岛β细胞损伤或功能下降是胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)的基 本病理机制。自由基和一氧化氮(NO)可以导致胰岛β细胞损伤[1]，清除自由基 及NO有助于保护胰岛β细胞。褪黑素是一种高效的内源性自由基清除剂，但有关褪黑素对胰 岛β细胞损伤保护作用的研究尚未报道。本研究采用链脲佐菌素(streptozotocin, STZ)所 致的离体胰岛细胞损伤模型，观察褪黑素对胰岛β细胞的保护作用，并初步探讨其机制。
1 材料和方法
1.1 试剂 RPMI-1640培养基购自Gibco公司；胶原酶(Ⅴ型，4 23U/mg)、STZ、Ficoll 400、DPH (1，6-dipheny 1,3,5-hexatrience)、噻唑蓝购自Sigm a公司；精制小牛血清来源于Hyclone公司。胰岛素放射免疫试剂盒由中国原子能研究院 提供。其余试剂为国产分析纯。
1.2 大鼠胰岛细胞制备 参照Gotoh等方法[2] ，略改进。成年SD大鼠，体重(179±54)g，雌雄不限(本校实验动物中心提供)。3%戊巴比妥 钠静脉麻醉，无菌条件下取胰腺，剪成1～2mm3大小，胶原酶1mg/ml，37℃消化15min后 ，分别过80、400目滤网，Ficoll 400不连续密度梯度离心分离胰岛，置于RPMI-1640(加15 %精制小牛血清、2mmol/L谷氨酰胺、10mmol/L Hepes、0.5%BSA、50mg/L庆大霉素)，37℃、 5%CO2培养箱中培养。
1.3 实验分组 取培养72h、生长良好的胰岛细胞离心换 液后，接种于24孔培养板，每孔约200个胰岛细胞。随机分为4组，每组18孔样本，正常对照 组：STZ 组(加入 STZ 共同孵育 24h，STZ 的终浓度为1mmol/L;褪黑素对照组(褪黑素预先24h加入，终浓度为10μmol/L)；褪黑素保护组( 褪黑素预先24h加入培养基后，加入STZ共同孵育24h，终浓度为10nmol/L和10μmol/L)。
1.4 胰岛细胞形态学观察 在倒置显微镜下观察加STZ前 、加STZ 24h后各组胰岛细胞的形态学变化，并取少量细胞悬液进行胰岛细胞双硫棕染色 鉴定。在荧光显微镜下用口 丫啶橙-碘化丙啶双染色(490n m 激发光滤光片、510 nm光栅滤光 片)观察细胞存活情况。同时，将胰岛细胞经2.5%戊二醛固定，超薄切片，透射电镜观察。
1.5 胰岛细胞存活率检测[3] 将加STZ前、后 各组胰岛细胞移入96孔培养板，与噻唑蓝(0.5mg/ml)50μl、37℃共同孵育4h，离心弃上 清，加入二甲基亚砜200μl，采用酶联免疫检测仪测定各孔吸光值(波长560nm)，计算细胞 存活率。
1.6 胰岛β细胞分泌功能评价[4] 取各组胰 岛细胞，吸出上清，放射免疫法测定24h胰岛累积量。
胰岛素释放实验 胰岛细胞经Hanks液充分洗涤后，分别置于低糖(5.6mmol/ L葡葡糖)、高糖(16.7mmol/L葡葡糖)无血清RPMI-1640培养基中，37℃、5%CO2孵育4h ，测定培养基中胰岛素的4h累积量，评价胰岛细胞对葡萄糖刺激的反应性。
1.7 生化指标检测 ①NO测定[5] 取各组培 养基上清100μl加入96孔培养板，与100μl Griess试剂(1%对氨基苯磺酰胺和0.1%萘乙一 胺 等量混合)室温反应15min，用酶联免疫检测仪测定各孔吸光值(波长540nm)，以不同浓度 的NaNO2吸光值绘制标准曲线。②脂质过氧化物丙二醛(MDA)含量测定 采用硫代巴比妥 酸比色法。③超氧化物歧化酶(SOD)水平 采用放射免疫法测定。④胰岛细胞膜流动性测定 以DPH为荧光探针，应用荧光偏振技术测定。
1.8 统计学方法 胰岛素含量单位为μIU/ml，结果均采 用
±s表示，显著性检验采用两样本均数t检验。
2 结 果
2.1 胰岛细胞形态学观察 加STZ前的胰岛细胞悬浮在培养基中 ，暗黄色，折光性强。DTZ染色10min后，光镜下可见60%细胞团呈猩红色，为胰岛细胞特征 性染色，计数(1037±462)个细胞/个胰腺。口 丫啶橙-碘 化丙啶双染色绝大多数细胞(87%)呈 亮绿色，少量细胞(13%)为桔红色，说明绝大多数细胞存活良好。电镜下，膜结构完整，内 质网发达，细胞质中可见大量的分泌颗粒(图1)。对照组对胰岛细胞形态学改变不显著。
加STZ 6h后，胰岛开始变小、萎缩、折光性减弱、细胞碎片增多。24h后，部分胰岛 细胞死亡，缺乏正常结构，丫啶橙-碘化丙啶双染色见整个视野中多为桔红色细胞，活细胞 少见。电镜下，膜结构破坏，线粒体肿胀，大量的空泡形成，细胞核染色质浓集，部分核固 缩(图2)。褪黑素保护组低浓度(10nmol/L)时改变类似于STZ组。而高浓度(10μmol/L)时细 胞仍基本保持其正常形态结构，DTZ染色阳性的细胞团>50%；丫啶橙-碘化丙啶双染色活性 细胞占细胞总数的76%；电镜的改变较轻微(图3)。
图1 透射电镜
正常胰岛细胞膜结构完整，内质网发达，可见大量分泌颗粒 ×12000
图2 透射电镜
STZ 24h后，细胞膜结构破坏，缺乏完整的细胞器×8000
图3 透射电镜
褪黑素10μmol/L处理后，细胞结构改变不明显×12000
2.2 胰岛细胞存活率检测 表1显示STZ组细胞存活率较 正常对照组极显著的降低(P<0.01),褪黑素保护组低浓度时细胞存活率无明显增加，与S TZ组无显著性差异(P>0.05)，说明低浓度的褪黑素对STZ导致的细胞存活率降低无显著 的保护作用；高浓度时细胞存活率较STZ组显著增加(P<0.05)，与正常对照组无显著性 差异(P>0.05)。
2.3 胰岛细胞分泌功能评价 由表2可见，STZ可以抑制 累积胰岛素的释放，与正常对照组有极显著性差异(P<0.01)，而且，胰岛素释放试验表 明STZ组对葡萄糖的反应性下降。单纯10μmol/L褪黑素对累积胰岛素释放、胰岛素释放试验 无显著的影响。褪黑素保护组低浓度时胰岛素释放量高糖仅为低糖时的1.7倍；高浓度时胰 岛素释放量高糖仍为低糖组的4.6倍。说明褪黑素高浓度时胰岛β细胞分泌功能良好。
2.4 生化指标检测 表3显示STZ能够明显促进NO的产生 ，增加MDA的含量，胰岛细胞膜流动性下降，微粘度增高，与正常对照组有显著性差异(P <0.05)，但是STZ不影响SOD水平。褪黑素保护组低浓度时与STZ组无显著性差异，但高浓 度褪黑素可以抑制NO生成，抑制率为71%，降低MDA含量较STZ组达46%，同时能够提高SOD水 平，增加细胞膜流动性，较STZ组有显著性差异(P<0.05)。
表1 STZ和褪黑素对胰岛细胞存活率的影响 (±s) MTT值
正常对照组
STZ组
褪黑素对照组
褪黑素保护组
10nmol/ L
10μmol/L
OD值
0.526±0.035
0.207±0.046△
0.492±0.083*
0.233±0.074△
0.478±0.041*
△与正常对照组比较P<0.01；*与STZ组比较P<0.05表2 STZ和褪黑素对胰岛细胞分泌功能的影响 (±s) 功能指标
正常对照组
STZ组
褪黑素对照组
褪黑素保护组
10nmo l/L
10μmol/L
24h累积胰岛素量
78.3±6.5
42.9±2.5△
76.9±4.9*
54.1±8.3△
82.3±7.8*
低糖胰岛素释放量
16.2±0.7
11.8±0.4
15.3±0.4
11.4±0.6
13.1±1. 7
高糖胰岛素释放量
58.4±1.3
17.5±0.9
66.1±1.6
19.7±0.5
60.2±2.4
高糖/低糖
3.6±0.7
1.5±0.2△
4.3±0.5*
1.7±0.3△
4.6±0.9 *
△与正常对照组比较P<0.01；*与STZ组比较P<0.05表3 STZ组和褪黑素各组胰岛细胞生化指标比较 (±s) 生化指标
正常对照组
STZ组
褪黑素对照组
褪黑素保护组
10nmo l/L
10μmol/L
NO(μmol/L)
13.57±2.35
58.94±4.78△
10.46±5.36*
52.23±7.45△(71%)
22.91±3.66*
MDA(μmol/L)
4.299±0.612
6.823±1.074△
3.706±0.831*
6.248 ±0.571△(46%)
3.684±0.755*
SOD(Nu/ml)
94.85±17.14
89.18±23.61
114.93±28.47 *
92.30±14.96
110.38±22.53*
膜微粘度
1.837±0.064
2.749±0.109△
1.964±0.091*
2.647±0.1 24△
2.065±0.054*
膜流动性
5.768±0.314
3.309±0.815△
5.238±0.713*
3.466±0.57 2△
4.877±0.748*
△与正常对照组比较P<0.05;*与STZ组比较P<0.05()内数据为褪黑素组 较STZ组NO、MDA量下降的百分数
3 讨 论
STZ是经典的致糖尿病药物，具有活泼的烃基结构，可以直接损伤胰岛β细胞DNA，刺 激其释放H2O2。过量的H2O2及其转化形成的羟自由基引起细胞DNA断裂，增 加脂质过氧化物水平，抑制胰岛素释放[5]。此外，STZ存在亚硝基基团，可产生 胰岛β细胞毒物质-NO。NO参与许多自由基级联式反应，诱导胰岛β细胞凋亡[6] ；还能抑制线粒体功能，降低β细胞代谢和胰岛素分泌[7]。本研究结果证实，ST Z作用24h后，NO和脂质过氧化产物MDA生成增加，24h累积胰岛素释放量减少，胰岛β细胞对 葡萄糖的反应性降低。大量的MDA促使细胞膜支架蛋白发生交联，膜功能丧失，微粘度增高 ，流动性下降，最终影响了胰岛细胞的存活率。
褪黑素是松果体释放的激素，在调节昼夜节律、衰老等生理病理活动中起重要作用。更令人 感兴趣的是，一定浓度的褪黑素(μmol/L)是高效的内源性自由基清除剂。它有很强的脂溶 性，易于透过磷脂膜进入细胞，与多种自由基(单线态氧、超氧阴离子、羟自由基)结合，降 低这些自由基对细胞的损伤[8]。因此，许多研究已应用褪黑素对“氧应激”(oxi dative stress)状态进行保护，如缺氧-再灌损伤、凋亡等[9，10]。但是对于 胰岛β细胞损伤的保护尚未见报道。本文提示，褪黑素对正常的胰岛细胞形态、功能和生化 指标无显著的影响。但对于STZ诱导损伤的胰岛β细胞，高浓度的褪黑素有显著的保护作用 。可能的机制为：①由于褪黑素能够清除自由基，尤其是羟自由基，减少脂质过氧化物生成 ，使胰岛β细胞的氧化损伤减轻，膜微粘度降低，膜流动性增加。②本研究结果表明，褪黑 素可以抑制STZ诱导的NO的合成，使NO产生减少，削弱了STZ的细胞毒作用。③提高SOD等抗 氧化酶的活性。
此外，褪黑素对胰岛β细胞的保护作用可能是剂量依赖型的，药物浓度过低时无保护作用。 其保护作用的有效剂量范围尚待进一步研究。
陕西省自然科学研究项目基金资助(98SM64)
参考文献
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2.Gotoh M,Maki T,Kiyoizumi T et al.An improved method for isolation of mouse pancreatic islets[J].Transplantation, 1985;40(2)∶437
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4.金秀平，洪天配，李琼芳.硒、锌对链脲佐菌素所致胰岛氧化损伤的保护作用[ J].营养学报，1997；19(4)∶379
5.Kanto H,Fujii J, Seo HG et al.Apoptosis cell death triggered by ni tric oxide in pancreatic β-cells[J].Diabetes, 1995;44(7)∶733
6.Kwon NS,Lee SH ,Choi CS et al.Nitric oxide generation from strepoz otocin[J].FASEB J,1994;8(4)∶529
7.Corbett JA，McDaniel ML.Does nitric oxide mediate autoimmune destructi on of β-cell[J]? Diabetes,1992;41(8)∶897
8.Cagnoli CM,Atahay C,Kharlamova E et al.Melatonin protects neurons fr om singlet oxygen induced apoptosis [J].J Pineal Res, 1995;18(4)∶222
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10.Mayo JC,Sainz RM, Uria H et al.Melatonin prevents apoptosis induc ed by 6-hydroxydopamine in neuronal cells:implicatons for Parkinson′s disease [J ].J Pineal Res,1998;24(3)∶179
(1999-08-10收稿 1999-11-03修回)
作者：贾延劼 信照亮 胡海涛 任惠民 王唯析
单位：(西安医科大学基础医学院人体解剖学教研室 西安 710061)
关键词：β细胞；链脲佐菌素；褪黑素；自由基；一氧化氮
西安医科大学学报000104 摘要 用链脲佐菌素(STZ)作用于离体胰岛β细胞24 h，一 氧化氮(NO)、脂质过氧化产物丙二醛(MDA)生成增多，胰岛细胞膜流动性下降，微粘度增高 ， 同时胰岛素分泌功能降低，细胞存活率下降。预先给高浓度褪黑素(10μmol/L)处理24h者， 可减少NO、MDA的释放，提高超氧化物歧化酶的水平，使胰岛细胞的氧化损伤减轻，膜微粘 度降低，膜流动性增加，细胞存活率显著提高。但低浓度褪黑素(10nmol/L)无此作用。提示 高浓度褪黑素对STZ所致的胰岛β细胞损伤有一定的保护作用。
中图分类号 R587.102 文献标识码 A
文章编号 0258-0659(2000)01- 0013-03
Melatonin protects β-cell from streptozotocin induced injury
Jia Yanjie, Xin Zhaoliang, Hu Haitao
(Department of Anatomy，Xian Medical University， Xi′an 710061,China)
ABSTRACT In order to investigate the protective effe c t of melatonin on the β-cells injury induced by streptozotocin(STZ).STZ was i njected cells in vitro for 24h.The results showed that STZ was able to significantly increase nitric oxide (NO)and MDA production, redu ce accumulated insulin release and insulin release at glucose stimulation ,decre ase the membrane fluidity and cell viability of islets.After 24h pretreatment wi th 10μmol/L of melationin, it reversed the injury of STZ-treated β-cells by reducing NO and MDA production and enhancing SOD level.Howerver, 10nmol/L of mel atonin had no similar effects.Conclusion:It suggest that melatonin m ay play a protective role in β-cell injury induced by STZ.
KEY WORDS β-cell streptozotocin (STZ) melatonin free radical nitric oxide (NO)
胰岛β细胞损伤或功能下降是胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)的基 本病理机制。自由基和一氧化氮(NO)可以导致胰岛β细胞损伤[1]，清除自由基 及NO有助于保护胰岛β细胞。褪黑素是一种高效的内源性自由基清除剂，但有关褪黑素对胰 岛β细胞损伤保护作用的研究尚未报道。本研究采用链脲佐菌素(streptozotocin, STZ)所 致的离体胰岛细胞损伤模型，观察褪黑素对胰岛β细胞的保护作用，并初步探讨其机制。
1 材料和方法
1.1 试剂 RPMI-1640培养基购自Gibco公司；胶原酶(Ⅴ型，4 23U/mg)、STZ、Ficoll 400、DPH (1，6-dipheny 1,3,5-hexatrience)、噻唑蓝购自Sigm a公司；精制小牛血清来源于Hyclone公司。胰岛素放射免疫试剂盒由中国原子能研究院 提供。其余试剂为国产分析纯。
1.2 大鼠胰岛细胞制备 参照Gotoh等方法[2] ，略改进。成年SD大鼠，体重(179±54)g，雌雄不限(本校实验动物中心提供)。3%戊巴比妥 钠静脉麻醉，无菌条件下取胰腺，剪成1～2mm3大小，胶原酶1mg/ml，37℃消化15min后 ，分别过80、400目滤网，Ficoll 400不连续密度梯度离心分离胰岛，置于RPMI-1640(加15 %精制小牛血清、2mmol/L谷氨酰胺、10mmol/L Hepes、0.5%BSA、50mg/L庆大霉素)，37℃、 5%CO2培养箱中培养。
1.3 实验分组 取培养72h、生长良好的胰岛细胞离心换 液后，接种于24孔培养板，每孔约200个胰岛细胞。随机分为4组，每组18孔样本，正常对照 组：STZ 组(加入 STZ 共同孵育 24h，STZ 的终浓度为1mmol/L;褪黑素对照组(褪黑素预先24h加入，终浓度为10μmol/L)；褪黑素保护组( 褪黑素预先24h加入培养基后，加入STZ共同孵育24h，终浓度为10nmol/L和10μmol/L)。
1.4 胰岛细胞形态学观察 在倒置显微镜下观察加STZ前 、加STZ 24h后各组胰岛细胞的形态学变化，并取少量细胞悬液进行胰岛细胞双硫棕染色 鉴定。在荧光显微镜下用口 丫啶橙-碘化丙啶双染色(490n m 激发光滤光片、510 nm光栅滤光 片)观察细胞存活情况。同时，将胰岛细胞经2.5%戊二醛固定，超薄切片，透射电镜观察。
1.5 胰岛细胞存活率检测[3] 将加STZ前、后 各组胰岛细胞移入96孔培养板，与噻唑蓝(0.5mg/ml)50μl、37℃共同孵育4h，离心弃上 清，加入二甲基亚砜200μl，采用酶联免疫检测仪测定各孔吸光值(波长560nm)，计算细胞 存活率。
1.6 胰岛β细胞分泌功能评价[4] 取各组胰 岛细胞，吸出上清，放射免疫法测定24h胰岛累积量。
胰岛素释放实验 胰岛细胞经Hanks液充分洗涤后，分别置于低糖(5.6mmol/ L葡葡糖)、高糖(16.7mmol/L葡葡糖)无血清RPMI-1640培养基中，37℃、5%CO2孵育4h ，测定培养基中胰岛素的4h累积量，评价胰岛细胞对葡萄糖刺激的反应性。
1.7 生化指标检测 ①NO测定[5] 取各组培 养基上清100μl加入96孔培养板，与100μl Griess试剂(1%对氨基苯磺酰胺和0.1%萘乙一 胺 等量混合)室温反应15min，用酶联免疫检测仪测定各孔吸光值(波长540nm)，以不同浓度 的NaNO2吸光值绘制标准曲线。②脂质过氧化物丙二醛(MDA)含量测定 采用硫代巴比妥 酸比色法。③超氧化物歧化酶(SOD)水平 采用放射免疫法测定。④胰岛细胞膜流动性测定 以DPH为荧光探针，应用荧光偏振技术测定。
1.8 统计学方法 胰岛素含量单位为μIU/ml，结果均采 用
±s表示，显著性检验采用两样本均数t检验。2 结 果
2.1 胰岛细胞形态学观察 加STZ前的胰岛细胞悬浮在培养基中 ，暗黄色，折光性强。DTZ染色10min后，光镜下可见60%细胞团呈猩红色，为胰岛细胞特征 性染色，计数(1037±462)个细胞/个胰腺。口 丫啶橙-碘 化丙啶双染色绝大多数细胞(87%)呈 亮绿色，少量细胞(13%)为桔红色，说明绝大多数细胞存活良好。电镜下，膜结构完整，内 质网发达，细胞质中可见大量的分泌颗粒(图1)。对照组对胰岛细胞形态学改变不显著。
加STZ 6h后，胰岛开始变小、萎缩、折光性减弱、细胞碎片增多。24h后，部分胰岛 细胞死亡，缺乏正常结构，丫啶橙-碘化丙啶双染色见整个视野中多为桔红色细胞，活细胞 少见。电镜下，膜结构破坏，线粒体肿胀，大量的空泡形成，细胞核染色质浓集，部分核固 缩(图2)。褪黑素保护组低浓度(10nmol/L)时改变类似于STZ组。而高浓度(10μmol/L)时细 胞仍基本保持其正常形态结构，DTZ染色阳性的细胞团>50%；丫啶橙-碘化丙啶双染色活性 细胞占细胞总数的76%；电镜的改变较轻微(图3)。
图1 透射电镜
正常胰岛细胞膜结构完整，内质网发达，可见大量分泌颗粒 ×12000
图2 透射电镜
STZ 24h后，细胞膜结构破坏，缺乏完整的细胞器×8000
图3 透射电镜
褪黑素10μmol/L处理后，细胞结构改变不明显×12000
2.2 胰岛细胞存活率检测 表1显示STZ组细胞存活率较 正常对照组极显著的降低(P<0.01),褪黑素保护组低浓度时细胞存活率无明显增加，与S TZ组无显著性差异(P>0.05)，说明低浓度的褪黑素对STZ导致的细胞存活率降低无显著 的保护作用；高浓度时细胞存活率较STZ组显著增加(P<0.05)，与正常对照组无显著性 差异(P>0.05)。
2.3 胰岛细胞分泌功能评价 由表2可见，STZ可以抑制 累积胰岛素的释放，与正常对照组有极显著性差异(P<0.01)，而且，胰岛素释放试验表 明STZ组对葡萄糖的反应性下降。单纯10μmol/L褪黑素对累积胰岛素释放、胰岛素释放试验 无显著的影响。褪黑素保护组低浓度时胰岛素释放量高糖仅为低糖时的1.7倍；高浓度时胰 岛素释放量高糖仍为低糖组的4.6倍。说明褪黑素高浓度时胰岛β细胞分泌功能良好。
2.4 生化指标检测 表3显示STZ能够明显促进NO的产生 ，增加MDA的含量，胰岛细胞膜流动性下降，微粘度增高，与正常对照组有显著性差异(P <0.05)，但是STZ不影响SOD水平。褪黑素保护组低浓度时与STZ组无显著性差异，但高浓 度褪黑素可以抑制NO生成，抑制率为71%，降低MDA含量较STZ组达46%，同时能够提高SOD水 平，增加细胞膜流动性，较STZ组有显著性差异(P<0.05)。
表1 STZ和褪黑素对胰岛细胞存活率的影响 (
±s) MTT值正常对照组
STZ组
褪黑素对照组
褪黑素保护组
10nmol/ L
10μmol/L
OD值
0.526±0.035
0.207±0.046△
0.492±0.083*
0.233±0.074△
0.478±0.041*
△与正常对照组比较P<0.01；*与STZ组比较P<0.05表2 STZ和褪黑素对胰岛细胞分泌功能的影响 (
±s) 功能指标正常对照组
STZ组
褪黑素对照组
褪黑素保护组
10nmo l/L
10μmol/L
24h累积胰岛素量
78.3±6.5
42.9±2.5△
76.9±4.9*
54.1±8.3△
82.3±7.8*
低糖胰岛素释放量
16.2±0.7
11.8±0.4
15.3±0.4
11.4±0.6
13.1±1. 7
高糖胰岛素释放量
58.4±1.3
17.5±0.9
66.1±1.6
19.7±0.5
60.2±2.4
高糖/低糖
3.6±0.7
1.5±0.2△
4.3±0.5*
1.7±0.3△
4.6±0.9 *
△与正常对照组比较P<0.01；*与STZ组比较P<0.05表3 STZ组和褪黑素各组胰岛细胞生化指标比较 (
±s) 生化指标正常对照组
STZ组
褪黑素对照组
褪黑素保护组
10nmo l/L
10μmol/L
NO(μmol/L)
13.57±2.35
58.94±4.78△
10.46±5.36*
52.23±7.45△(71%)
22.91±3.66*
MDA(μmol/L)
4.299±0.612
6.823±1.074△
3.706±0.831*
6.248 ±0.571△(46%)
3.684±0.755*
SOD(Nu/ml)
94.85±17.14
89.18±23.61
114.93±28.47 *
92.30±14.96
110.38±22.53*
膜微粘度
1.837±0.064
2.749±0.109△
1.964±0.091*
2.647±0.1 24△
2.065±0.054*
膜流动性
5.768±0.314
3.309±0.815△
5.238±0.713*
3.466±0.57 2△
4.877±0.748*
△与正常对照组比较P<0.05;*与STZ组比较P<0.05()内数据为褪黑素组 较STZ组NO、MDA量下降的百分数
3 讨 论
STZ是经典的致糖尿病药物，具有活泼的烃基结构，可以直接损伤胰岛β细胞DNA，刺 激其释放H2O2。过量的H2O2及其转化形成的羟自由基引起细胞DNA断裂，增 加脂质过氧化物水平，抑制胰岛素释放[5]。此外，STZ存在亚硝基基团，可产生 胰岛β细胞毒物质-NO。NO参与许多自由基级联式反应，诱导胰岛β细胞凋亡[6] ；还能抑制线粒体功能，降低β细胞代谢和胰岛素分泌[7]。本研究结果证实，ST Z作用24h后，NO和脂质过氧化产物MDA生成增加，24h累积胰岛素释放量减少，胰岛β细胞对 葡萄糖的反应性降低。大量的MDA促使细胞膜支架蛋白发生交联，膜功能丧失，微粘度增高 ，流动性下降，最终影响了胰岛细胞的存活率。
褪黑素是松果体释放的激素，在调节昼夜节律、衰老等生理病理活动中起重要作用。更令人 感兴趣的是，一定浓度的褪黑素(μmol/L)是高效的内源性自由基清除剂。它有很强的脂溶 性，易于透过磷脂膜进入细胞，与多种自由基(单线态氧、超氧阴离子、羟自由基)结合，降 低这些自由基对细胞的损伤[8]。因此，许多研究已应用褪黑素对“氧应激”(oxi dative stress)状态进行保护，如缺氧-再灌损伤、凋亡等[9，10]。但是对于 胰岛β细胞损伤的保护尚未见报道。本文提示，褪黑素对正常的胰岛细胞形态、功能和生化 指标无显著的影响。但对于STZ诱导损伤的胰岛β细胞，高浓度的褪黑素有显著的保护作用 。可能的机制为：①由于褪黑素能够清除自由基，尤其是羟自由基，减少脂质过氧化物生成 ，使胰岛β细胞的氧化损伤减轻，膜微粘度降低，膜流动性增加。②本研究结果表明，褪黑 素可以抑制STZ诱导的NO的合成，使NO产生减少，削弱了STZ的细胞毒作用。③提高SOD等抗 氧化酶的活性。
此外，褪黑素对胰岛β细胞的保护作用可能是剂量依赖型的，药物浓度过低时无保护作用。 其保护作用的有效剂量范围尚待进一步研究。
陕西省自然科学研究项目基金资助(98SM64)
参考文献
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10.Mayo JC,Sainz RM, Uria H et al.Melatonin prevents apoptosis induc ed by 6-hydroxydopamine in neuronal cells:implicatons for Parkinson′s disease [J ].J Pineal Res,1998;24(3)∶179
(1999-08-10收稿 1999-11-03修回)
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