恒定均匀磁场对肿瘤细胞调亡Bcl-2及Bax蛋白表达的研究
http://www.100md.com
强永乾. 郭佑民. 鱼博浪. 张明.
恒定均匀磁场.Walker-256.细胞调亡.Bcl-2.Bax.
参见附件(89kb)。
作者：强永乾 郭佑民 鱼博浪 张明
单位：(西安医科大学第一附属医院影像中心 西安 710061)
关键词：恒定均匀磁场；Walker-256；细胞调亡；Bcl-2；Bax
西安医科大学学报000204
摘要 目的 探讨磁场对肿瘤细胞凋亡及其相关基因Bcl-2及Bax蛋白表达的影响，揭示磁场抗癌作用的分子机制。方法 460只SD大鼠右下肢皮下移植Walker-256瘤株，常规饲养2周后，随机选择400只分为荷瘤对照组和荷瘤实验组。实验组每日接受不同强度不同时间的磁场处理，持续2周，观察瘤鼠存活率，然后处死，测量瘤体体积及湿重，最后行HE及免疫组化染色。结果 与对照组比较，实验组大鼠存活率(84.28%)增高，肿瘤体积(1.78cm3±0.82cm3)及肿瘤湿重(2.20g±1.43g)明显减小(P<0.05)。病理组织学检查可见细胞凋亡的数目明显增多。Bcl-2蛋白阳性表达率(18%)低于对照组，Bax蛋白阳性表达率(43%)高于对照组(P<0.05)，Bcl-2/Bax的比值低于对照组。结论 恒定均匀磁场的作用结果使凋亡相关基因Bcl-2蛋白的表达下调，Bax蛋白的表达增高，Bcl-2/Bax的比值减小，是诱导肿瘤细胞凋亡的原因之一。
中图分类号 R811.5 Q345+.2 文献标识码 A 文章编号 0258-0659(2000)02-0100-04
Effect of harmonious static magnet field (HSMF)on expression of apoptosisralated gene Bcl-2 and Bax protein in Walker-256-implanted rats
Qiang Yongqian Guo Youmin Yu Bolang
(Center of Imaging ,First Affiliated Hospital ,Xi′an Medical University,Xian 710061,China)
ABSTRACT Objective To study the expression of Bcl-2 and Bax proteins,to explore the molecular mechanism of antitumor effect and supply data and vidences in the treatment of tumors on Walker-256-implanted rats following HSMF. Methods Walker-256 carcinoma cells line was transplated into the right thighs of 460 SD rats,400 of 460 samples were divided into 2 qroups randomly:the tumor experiment group and the tumor control group on the basis of completely random principle after being fed with 2 weeks on routine.The experiment group were exposed to differential power and time magetic field every day, to continue 2 weeks and observe the survival rate of rats, then to measure volume and wet weighty of the body of sarcoma, in the last HE and ABC immunohistochemistry staining method were used.Results In the period of experiment, it was found that SD rats surrival rate(84.28%) was increased ,sarcoma volume and wet weighty were significantly decreased when compared with the tumor control group (P<0.05).The pathology examination showed that the number of apoptosis were significantly increased.The positive expression rate (18%) of Bcl-2 protein were decreased, the expression of Bax gene was contrary to Bcl-2 gene and the ratio of Bcl-2/Bax was significantly decreased.There was significant differenced in 2 groups (P<0.05).Conclusion HSM can decrease the expression of Bcl-2 gene, increase the expression of Bax and decrease the ratio of Bcl-2/Bax.It suggested that it achieved its antitumor effect by inducing apoptosis of SD rats transplation sarcoma cells .HSM showed a potentiation of the antitumor effect as a clinically new useful tool.
KEY WORDS harmonious static magnet field(HSMF) walker-256 apoptosis Bcl-2 Bax 近年来的研究证实，细胞凋亡可由特定的刺激因素所诱导。因此，寻求不同的方法诱导细胞凋亡，使其选择性地发生于肿瘤细胞是肿瘤治疗学研究的热点问题之一。磁场作为一种新的手段治疗肿瘤，已在实验中获得证实[1,2]。但是，有关强恒磁场与细胞凋亡相关基因如Bcl-2、Bax等关系的研究报告不多，本文就此方面进行了研究。
1 材料和方法
1.1 实验材料
1.1.1 研究对象 纯种SD大鼠460只，鼠龄(50±5)d，体重(100±20)g，雌雄各半，由西安医科大学动物实验中心提供。Walker-256瘤株，由西安医科大学第一临床医学院分子生物学研究中心李旭教授惠赠。
1.1.2 磁场来源 恒定均匀磁场分别来自：(1)西安市红会医院影像中心Asm0.15T永磁型磁共振系统，场强为0.15T恒定均匀磁场。(2)西安医科大学第一附属医院影像中心美国Diasonics 0.35T超导型磁共振系统，场强为0.35T恒定均匀磁场。(3)西安医科大学第二附属医院PHILIPSGyroscan-NT5-0.5T超导型磁共振系统，场强为0.5T恒定均匀磁场。(4)第四军医大学西京医院影像中心西门子SP4000 1.5T超导型磁共振系统，场强为1.5T恒定均匀磁场。
1.1.3 主要试剂 一抗：Bcl-2山羊IgG多抗100μg/ml，Bax兔IgG多抗100μg/ml，均为Santa Cruz公司产品。试剂盒购自博士德公司。
1.1.4 动物模型的复制 复苏Walker-256瘤株。从液氮中取出Walker-256瘤株，放37℃水浴5min，植入含10%胎牛血清DMEM培养基中。37℃ 5%CO2培养箱中72h，细胞长满后，用胰酶消化成单个细胞，悬浮在无血清的DMEM培养基中，常规靛蓝染色和细胞计数，要求细胞活力大于95%。每只SD大鼠腹腔接种细胞数为10×106。接种8d后，取血性腹水离心，用无菌Hankers液洗涤，再次经过靛蓝计数测活力，要求活力大于95%。然后其余SD大鼠按每只接种细胞4×106，接种于大鼠右后肢内侧皮下，接种3d后皮下长出肿瘤结节者选出400只作为荷瘤实验动物。
1.2 实验方法
1.2.1 动物分组 取荷瘤大鼠400只，随机分成对照组及磁场处理组，磁场处理强度分别为0.15、0.35、0.5、1.5T。每组20只大鼠。磁场处理组和未处理组动物饲养条件相同，每天观察各组动物饮食和精神状况。实验组动物按设计的磁场强度和时间进行曝磁，对照组则置于磁场外。连续实验14d后，麻醉处死各组动物，同时统计每组动物实验期间的死亡数目。
1.2.2 取材及样品处理 荷瘤大鼠用乌拉坦(0.6ml/100mg体重)腹腔注射麻醉后，打开胸腔，用300ml生理盐水从左心室灌注冲洗，再用4%多聚甲醛(PBS配制)300ml缓慢灌注固定。同时切开其右后肢皮肤分离瘤体(再取肝、胆、脾、肾等器官备用)，按分组编号加比例尺拍照，测量每只动物荷瘤体积的长径(A)及短径(B)，计算肿瘤体积V(cm3)=3.14×6[(A+B)/2]3[3]，再用天平称肿瘤重量。常规石蜡包埋行HE及免疫组织ABC法染色。
1.3 Walker-256肿瘤细胞凋亡及Bcl-2、Bax的分析方法
1.3.1 光镜观察方法 HE染色观察：未经磁场处理组随机抽取20张切片，处理组每亚组随机取10张切片，以相同放大倍数和光亮度在显微镜下观察。
1.3.2 Bcl-2、Bax基因免疫组化染色结果判定方法 Bcl-2、Bax阳性表现为细胞浆黄染，其表达强度：(-)无胞浆染色(阴性)，(+)胞浆染色(阳性)。在双人双目显微镜下观察，选取细胞分布均匀的5个高倍(×400)视野作为观察区，两个观察者同时判断蛋白的表达阳性、阴性和分别计算各级别细胞数，求5个视野内细胞数的平均值，计算阳性细胞数。阴性对照：一抗以PBS代替或山羊血清代替。阳性对照：以已知Bcl-2、Bax阳性的存档切片为对照，由西安医科大学一附院病理科提供。
2 结 果
2.1 SD荷瘤大鼠存活率、肿瘤体积和湿重的比较
经强恒磁场(0.15、0.35、0.5、1.5T)处理的Walker-256荷瘤大鼠实验结束后存活数为268只，未处理组56只。同未经磁场处理组比较其实验阶段的存活率有明显提高。见表1，表2。
2.2 病理组织学特征
肉眼观察：对照组肿瘤表面可见点状瘀血区，未见包膜，切面呈灰红色鱼肉状，质硬。实验组肿瘤表面可见大片瘀血区，切面可见中央坏死区，其周围可见少部分呈灰红色鱼肉状，质较软。光镜下观察：对照组可见癌细胞生长活跃，细胞密集，间质少呈片状分布，癌细胞呈圆形，细胞边界清楚，核大，胞浆丰富，染色清楚，核结构清晰，核分裂相多见。实验组曝磁14d后见坏死边缘有肉芽组织充填，癌细胞少见，可见多量散在凋亡小体(图1)。
表1 实验组与对照组存活率的比较 组 别
例数
存活
死亡
存活率(%)
对照组
80
56
26
70.89
实验组
320
268
52
84.28
χ2=7.56，P<0.05
图1 对照组HE染色肿瘤细胞数量少，淋巴细胞散在，凋亡小体样结构明显增多 ×200
图2 对照组ABC法染色Bax蛋白强阳性表达 ×400
图3 对照组ABC法染色Bcl-2蛋白弱阳性表达 ×400
2.3 免疫组织化学染色特点
Bcl-2、Bax蛋白阳性表达产物位于胞浆，少数胞膜染色，呈黄色或棕黄色(图2，3)。经磁场处理后，实验组与对照组之间Bcl-2、Bax阳性表达率及Bcl-2/Bax比值的比较(见表3)。
表2 实验组与对照组肿瘤体积的比较 (
±s) 组 别
例数
体积(cm3)
湿重(g)
对照组
56
3.54±1.22
4.35±1.43
实验组
268
1.78±0.82
2.20±1.43**
τ=10.4,P<0.05,τ=8.86,P<0.05表3 实验组与对照组Bcl-2及Bax阳性表达率的比较 组 别
例数
Bcl-2阳性
(%)
Bax阳
性(%)
Bcl-2/
Bax
对照组
56
40
27
1.48
实验组
268
18
43
0.42
χ2=15.61,P<0.01;χ2=5.23,P<0.05
3 讨 论
恶性肿瘤是当今世界危及人类生命的主要疾病之一，积极有效的治疗至今仍未获得突破性进展。人们仍在不断探索和寻求治疗肿瘤的各种方法。应用磁场的物理特性，对肿瘤进行治疗是近年来才开始研究的课题，可望为恶性肿瘤的综合治疗提供新的途径和方法。
3.1 恒定均匀磁场对肿瘤的作用
恒定均匀磁场是由于优化磁路设计的超导磁体或恒磁体所产生的磁场。它的主要特点是要求磁场在一定范围内磁场强度保持均匀恒定。恒定均匀磁场的强度一般为0.05～1.5T，有的可达2～4T。主要应用于医学成像和波谱学的研究。因此，MRI的恒定均匀磁场可作为一种新的研究手段，用于肿瘤的研究。杜红文等[4]报告，将S180肉瘤细胞2×105/0.2ml接种于雄性小鼠右腋下，随机分为对照组和实验组在0.35T强恒磁场作用30min,60min及120min组，每日曝磁1次，持续14d，结果显示，磁场处理组瘤体减轻，以120min为明显，抑瘤率32.45%。刘华等[5]应用恒定均匀磁场研究对特异性杀伤细胞的影响时发现，经磁场处理后，特异性杀伤细胞毒作用增强。我们用恒定均匀磁场处理Walker-256荷瘤大鼠，发现肿瘤体积平均为(1.78±0.82)cm3，而对照组肿瘤体积平均为(3.54±1.22)cm3，两组之间差异具有非常显著性(P<0.01)。肉眼见肿瘤表面大片瘀血区，切面见中央坏死，镜下见肿瘤中央坏死，边缘有肉芽组织生长，少数残存的癌细胞呈分散分布，有的全为肉芽组织充填未见癌细胞，可见多量散在凋亡小体。而对照组肉眼见肿瘤组织表面点状瘀血区，未见包膜。切面呈鱼肉状、质硬，镜下见癌细胞生长活跃，细胞密集，间质少，核分裂相多见，并见散在凋亡小体。同时观察到处理组瘤体平均湿重(2.20±1.43)g，而对照组平均湿重(4.35±1.43)g，两组有显著差异(P<0.01)，而且在实验过程中，实验组SD大鼠存活率为84.28%，而对照组为70.89%，差异具有显著性。P<0.05。我们的实验结果进一步证实，恒强磁场可抑制瘤体生长，并且降低荷瘤鼠的死亡率，同时又发现恒强磁场可以增加肿瘤组织细胞凋亡的数目。
3.2 恒定均匀磁场对细胞凋亡相关基因的影响
近年来的研究表明，细胞凋亡可由多种因素包括放疗、化疗、高温、电离辐射等诱导产生，其中p53、Bcl-2家族、C-myc、细胞凋亡1等基因在细胞凋亡过程中起到了重要的作用，研究强恒磁场下肿瘤细胞凋亡相关基因的变化将有利于揭示磁场抗癌作用的机理。
3.2.1 Bcl-2、Bax在细胞中的定位及分布 研究证实[6,9]，Bcl-2蛋白在细胞中主要定位于核外膜、线粒体外膜和内质网，在肿瘤标本的癌上皮中呈随机分布。本实验观察到Bcl-2染色主要定位于细胞浆，胞膜有少数染色，呈颗粒状或绕核分布，偶可均匀分布于胞浆。Bax蛋白阳性表达产物呈黄色或棕黄色，位于胞浆，少数细胞膜染色[10]。我们的实验表明Bax蛋白表达产物的定位、分布与文献结果一致。
3.2.2 磁场与Bcl-2蛋白的关系 Bcl-2是B-细胞淋巴瘤/白血病-2基因(B-cell lymphoma leukemia-2 gene)的缩写[6]。1985年Tsujimoto[7]在许多非何杰金氏B细胞淋巴瘤中发现。Bcl-2基因在调控细胞程序性死亡中具有重要意义，许多物理化学因素可以诱导细胞凋亡，Bcl-2基因的产物Bcl-2蛋白可以抑制细胞凋亡，延长细胞的生存。我们的实验结果显示，Walker-256荷瘤鼠经过恒定均匀磁场的曝磁处理后，镜下有大量的肿瘤细胞凋亡。免疫组化证实Bcl-2蛋白表达阳性率低于对照组(P<0.05)，提示磁场可以诱导细胞凋亡，并且使荷瘤鼠Bcl-2基因表达水平下调，进而说明恒定均匀磁场抑制肿瘤生长的机理是通过诱导肿瘤细胞凋亡而实现的。
3.2.3 磁场与Bax蛋白的关系 Bax是Bcl-2家族中的重要成员。研究发现，Bax基因长4.4kb，含有6个外显子，可以通过不同的剪接方式编码三种蛋白Bcl-α，β，γ。Bax基因是Bcl-2基因家族的新成员，它与Bcl-2基因有40%的同源性，但生理作用却相反。通过实验研究，我们观察到经过恒定均匀磁场处理后的荷瘤鼠肿瘤组织中Bax蛋白阳性表达率明显高于对照组。证明磁场可以作为一个凋亡发生的有效刺激因素，致使Bax基因表达增强。
3.2.4 磁场与Bcl-2/Bax比值的关系 许多研究表明[12]Bcl-2和Bax的表达程度与比值决定了细胞接受凋亡信号后的命运。在Bax基因占优势时，细胞发生凋亡；Bcl-2基因占优势时，细胞存活。本实验结果发现接受磁场作用后Bcl-2/Bax比值明显低于对照组，证明磁场可加速肿瘤细胞凋亡的发生，从而达到抑制肿瘤生长的作用。
国家自然科学基金项目(No:3950191)
参考文献
1，Pich EM, West AI.Exposure to stong static magnetic-field induces by poactivity in veaning mice[J].J Bioeletr,1991;10(1)∶50
2，Miyakoshi J,Ohtsu S, Shibta T et al.Exposure to magnetic field (5mT at 60Hz) dose not affect cell growth and c-myc gene expression[J].J Aadiat Res(Tokyo).1996;37(3)∶185
3，Jones EL,Lyons BE,Douple EB et al.Thermal enhancement of low dose rate irradiation in a murine tumor system[J].Int J Hyperthermia,1989;5(4)∶509
4，杜红文，郭佑民，张 明.磁场对小鼠S180肉瘤的抑制作用.中华理疗杂志，1992；15(2)∶80
5，刘 华，郭佑民，司履生等.强磁场对荷瘤小鼠特异性细胞毒效效应的影响.中华理疗杂志，1993；16(3)∶148
6 Reed JC.Bcl-2 and the regulation of programmed cell death[J].J Cell Biol,1994;124(1～2)∶1
7，Tsujimoto Y.Involvement of the Bcl-2 gene in human folliculer lymphoma[J].Science,1985;228(4706)∶1440
8，Vanx DL,Corgs, Adams JM.Bcl-2 gene promotes haemopioetic cell survival and cooperates with C-myc to immortalize pre-B cells[J].Nature,1988;335(6189)∶440
9，Hockenbery DM,Nunez G,Milliman C et al.Bcl-2 as an inner mitochondrial membrane protein that blocks programmed cell death[J].Nature ,1990;348(6299)334
10，Oltivai AN,Milliman CL,Korsmeyer SJ.Bcl-2 Heterodimerizes in vivo with a conserves hemology,Bax that accelerates programmed cell death[J].Cell ,1993;74(4)∶609
(1999-10-10收稿 1999-11-25修回)
作者：强永乾 郭佑民 鱼博浪 张明
单位：(西安医科大学第一附属医院影像中心 西安 710061)
关键词：恒定均匀磁场；Walker-256；细胞调亡；Bcl-2；Bax
西安医科大学学报000204
摘要 目的 探讨磁场对肿瘤细胞凋亡及其相关基因Bcl-2及Bax蛋白表达的影响，揭示磁场抗癌作用的分子机制。方法 460只SD大鼠右下肢皮下移植Walker-256瘤株，常规饲养2周后，随机选择400只分为荷瘤对照组和荷瘤实验组。实验组每日接受不同强度不同时间的磁场处理，持续2周，观察瘤鼠存活率，然后处死，测量瘤体体积及湿重，最后行HE及免疫组化染色。结果 与对照组比较，实验组大鼠存活率(84.28%)增高，肿瘤体积(1.78cm3±0.82cm3)及肿瘤湿重(2.20g±1.43g)明显减小(P<0.05)。病理组织学检查可见细胞凋亡的数目明显增多。Bcl-2蛋白阳性表达率(18%)低于对照组，Bax蛋白阳性表达率(43%)高于对照组(P<0.05)，Bcl-2/Bax的比值低于对照组。结论 恒定均匀磁场的作用结果使凋亡相关基因Bcl-2蛋白的表达下调，Bax蛋白的表达增高，Bcl-2/Bax的比值减小，是诱导肿瘤细胞凋亡的原因之一。
中图分类号 R811.5 Q345+.2 文献标识码 A 文章编号 0258-0659(2000)02-0100-04
Effect of harmonious static magnet field (HSMF)on expression of apoptosisralated gene Bcl-2 and Bax protein in Walker-256-implanted rats
Qiang Yongqian Guo Youmin Yu Bolang
(Center of Imaging ,First Affiliated Hospital ,Xi′an Medical University,Xian 710061,China)
ABSTRACT Objective To study the expression of Bcl-2 and Bax proteins,to explore the molecular mechanism of antitumor effect and supply data and vidences in the treatment of tumors on Walker-256-implanted rats following HSMF. Methods Walker-256 carcinoma cells line was transplated into the right thighs of 460 SD rats,400 of 460 samples were divided into 2 qroups randomly:the tumor experiment group and the tumor control group on the basis of completely random principle after being fed with 2 weeks on routine.The experiment group were exposed to differential power and time magetic field every day, to continue 2 weeks and observe the survival rate of rats, then to measure volume and wet weighty of the body of sarcoma, in the last HE and ABC immunohistochemistry staining method were used.Results In the period of experiment, it was found that SD rats surrival rate(84.28%) was increased ,sarcoma volume and wet weighty were significantly decreased when compared with the tumor control group (P<0.05).The pathology examination showed that the number of apoptosis were significantly increased.The positive expression rate (18%) of Bcl-2 protein were decreased, the expression of Bax gene was contrary to Bcl-2 gene and the ratio of Bcl-2/Bax was significantly decreased.There was significant differenced in 2 groups (P<0.05).Conclusion HSM can decrease the expression of Bcl-2 gene, increase the expression of Bax and decrease the ratio of Bcl-2/Bax.It suggested that it achieved its antitumor effect by inducing apoptosis of SD rats transplation sarcoma cells .HSM showed a potentiation of the antitumor effect as a clinically new useful tool.
KEY WORDS harmonious static magnet field(HSMF) walker-256 apoptosis Bcl-2 Bax 近年来的研究证实，细胞凋亡可由特定的刺激因素所诱导。因此，寻求不同的方法诱导细胞凋亡，使其选择性地发生于肿瘤细胞是肿瘤治疗学研究的热点问题之一。磁场作为一种新的手段治疗肿瘤，已在实验中获得证实[1,2]。但是，有关强恒磁场与细胞凋亡相关基因如Bcl-2、Bax等关系的研究报告不多，本文就此方面进行了研究。
1 材料和方法
1.1 实验材料
1.1.1 研究对象 纯种SD大鼠460只，鼠龄(50±5)d，体重(100±20)g，雌雄各半，由西安医科大学动物实验中心提供。Walker-256瘤株，由西安医科大学第一临床医学院分子生物学研究中心李旭教授惠赠。
1.1.2 磁场来源 恒定均匀磁场分别来自：(1)西安市红会医院影像中心Asm0.15T永磁型磁共振系统，场强为0.15T恒定均匀磁场。(2)西安医科大学第一附属医院影像中心美国Diasonics 0.35T超导型磁共振系统，场强为0.35T恒定均匀磁场。(3)西安医科大学第二附属医院PHILIPSGyroscan-NT5-0.5T超导型磁共振系统，场强为0.5T恒定均匀磁场。(4)第四军医大学西京医院影像中心西门子SP4000 1.5T超导型磁共振系统，场强为1.5T恒定均匀磁场。
1.1.3 主要试剂 一抗：Bcl-2山羊IgG多抗100μg/ml，Bax兔IgG多抗100μg/ml，均为Santa Cruz公司产品。试剂盒购自博士德公司。
1.1.4 动物模型的复制 复苏Walker-256瘤株。从液氮中取出Walker-256瘤株，放37℃水浴5min，植入含10%胎牛血清DMEM培养基中。37℃ 5%CO2培养箱中72h，细胞长满后，用胰酶消化成单个细胞，悬浮在无血清的DMEM培养基中，常规靛蓝染色和细胞计数，要求细胞活力大于95%。每只SD大鼠腹腔接种细胞数为10×106。接种8d后，取血性腹水离心，用无菌Hankers液洗涤，再次经过靛蓝计数测活力，要求活力大于95%。然后其余SD大鼠按每只接种细胞4×106，接种于大鼠右后肢内侧皮下，接种3d后皮下长出肿瘤结节者选出400只作为荷瘤实验动物。
1.2 实验方法
1.2.1 动物分组 取荷瘤大鼠400只，随机分成对照组及磁场处理组，磁场处理强度分别为0.15、0.35、0.5、1.5T。每组20只大鼠。磁场处理组和未处理组动物饲养条件相同，每天观察各组动物饮食和精神状况。实验组动物按设计的磁场强度和时间进行曝磁，对照组则置于磁场外。连续实验14d后，麻醉处死各组动物，同时统计每组动物实验期间的死亡数目。
1.2.2 取材及样品处理 荷瘤大鼠用乌拉坦(0.6ml/100mg体重)腹腔注射麻醉后，打开胸腔，用300ml生理盐水从左心室灌注冲洗，再用4%多聚甲醛(PBS配制)300ml缓慢灌注固定。同时切开其右后肢皮肤分离瘤体(再取肝、胆、脾、肾等器官备用)，按分组编号加比例尺拍照，测量每只动物荷瘤体积的长径(A)及短径(B)，计算肿瘤体积V(cm3)=3.14×6[(A+B)/2]3[3]，再用天平称肿瘤重量。常规石蜡包埋行HE及免疫组织ABC法染色。
1.3 Walker-256肿瘤细胞凋亡及Bcl-2、Bax的分析方法
1.3.1 光镜观察方法 HE染色观察：未经磁场处理组随机抽取20张切片，处理组每亚组随机取10张切片，以相同放大倍数和光亮度在显微镜下观察。
1.3.2 Bcl-2、Bax基因免疫组化染色结果判定方法 Bcl-2、Bax阳性表现为细胞浆黄染，其表达强度：(-)无胞浆染色(阴性)，(+)胞浆染色(阳性)。在双人双目显微镜下观察，选取细胞分布均匀的5个高倍(×400)视野作为观察区，两个观察者同时判断蛋白的表达阳性、阴性和分别计算各级别细胞数，求5个视野内细胞数的平均值，计算阳性细胞数。阴性对照：一抗以PBS代替或山羊血清代替。阳性对照：以已知Bcl-2、Bax阳性的存档切片为对照，由西安医科大学一附院病理科提供。
2 结 果
2.1 SD荷瘤大鼠存活率、肿瘤体积和湿重的比较
经强恒磁场(0.15、0.35、0.5、1.5T)处理的Walker-256荷瘤大鼠实验结束后存活数为268只，未处理组56只。同未经磁场处理组比较其实验阶段的存活率有明显提高。见表1，表2。
2.2 病理组织学特征
肉眼观察：对照组肿瘤表面可见点状瘀血区，未见包膜，切面呈灰红色鱼肉状，质硬。实验组肿瘤表面可见大片瘀血区，切面可见中央坏死区，其周围可见少部分呈灰红色鱼肉状，质较软。光镜下观察：对照组可见癌细胞生长活跃，细胞密集，间质少呈片状分布，癌细胞呈圆形，细胞边界清楚，核大，胞浆丰富，染色清楚，核结构清晰，核分裂相多见。实验组曝磁14d后见坏死边缘有肉芽组织充填，癌细胞少见，可见多量散在凋亡小体(图1)。
表1 实验组与对照组存活率的比较 组 别
例数
存活
死亡
存活率(%)
对照组
80
56
26
70.89
实验组
320
268
52
84.28
χ2=7.56，P<0.05
图1 对照组HE染色肿瘤细胞数量少，淋巴细胞散在，凋亡小体样结构明显增多 ×200
图2 对照组ABC法染色Bax蛋白强阳性表达 ×400
图3 对照组ABC法染色Bcl-2蛋白弱阳性表达 ×400
2.3 免疫组织化学染色特点
Bcl-2、Bax蛋白阳性表达产物位于胞浆，少数胞膜染色，呈黄色或棕黄色(图2，3)。经磁场处理后，实验组与对照组之间Bcl-2、Bax阳性表达率及Bcl-2/Bax比值的比较(见表3)。
表2 实验组与对照组肿瘤体积的比较 (
±s) 组 别例数
体积(cm3)
湿重(g)
对照组
56
3.54±1.22
4.35±1.43
实验组
268
1.78±0.82
2.20±1.43**
τ=10.4,P<0.05,τ=8.86,P<0.05表3 实验组与对照组Bcl-2及Bax阳性表达率的比较 组 别
例数
Bcl-2阳性
(%)
Bax阳
性(%)
Bcl-2/
Bax
对照组
56
40
27
1.48
实验组
268
18
43
0.42
χ2=15.61,P<0.01;χ2=5.23,P<0.05
3 讨 论
恶性肿瘤是当今世界危及人类生命的主要疾病之一，积极有效的治疗至今仍未获得突破性进展。人们仍在不断探索和寻求治疗肿瘤的各种方法。应用磁场的物理特性，对肿瘤进行治疗是近年来才开始研究的课题，可望为恶性肿瘤的综合治疗提供新的途径和方法。
3.1 恒定均匀磁场对肿瘤的作用
恒定均匀磁场是由于优化磁路设计的超导磁体或恒磁体所产生的磁场。它的主要特点是要求磁场在一定范围内磁场强度保持均匀恒定。恒定均匀磁场的强度一般为0.05～1.5T，有的可达2～4T。主要应用于医学成像和波谱学的研究。因此，MRI的恒定均匀磁场可作为一种新的研究手段，用于肿瘤的研究。杜红文等[4]报告，将S180肉瘤细胞2×105/0.2ml接种于雄性小鼠右腋下，随机分为对照组和实验组在0.35T强恒磁场作用30min,60min及120min组，每日曝磁1次，持续14d，结果显示，磁场处理组瘤体减轻，以120min为明显，抑瘤率32.45%。刘华等[5]应用恒定均匀磁场研究对特异性杀伤细胞的影响时发现，经磁场处理后，特异性杀伤细胞毒作用增强。我们用恒定均匀磁场处理Walker-256荷瘤大鼠，发现肿瘤体积平均为(1.78±0.82)cm3，而对照组肿瘤体积平均为(3.54±1.22)cm3，两组之间差异具有非常显著性(P<0.01)。肉眼见肿瘤表面大片瘀血区，切面见中央坏死，镜下见肿瘤中央坏死，边缘有肉芽组织生长，少数残存的癌细胞呈分散分布，有的全为肉芽组织充填未见癌细胞，可见多量散在凋亡小体。而对照组肉眼见肿瘤组织表面点状瘀血区，未见包膜。切面呈鱼肉状、质硬，镜下见癌细胞生长活跃，细胞密集，间质少，核分裂相多见，并见散在凋亡小体。同时观察到处理组瘤体平均湿重(2.20±1.43)g，而对照组平均湿重(4.35±1.43)g，两组有显著差异(P<0.01)，而且在实验过程中，实验组SD大鼠存活率为84.28%，而对照组为70.89%，差异具有显著性。P<0.05。我们的实验结果进一步证实，恒强磁场可抑制瘤体生长，并且降低荷瘤鼠的死亡率，同时又发现恒强磁场可以增加肿瘤组织细胞凋亡的数目。
3.2 恒定均匀磁场对细胞凋亡相关基因的影响
近年来的研究表明，细胞凋亡可由多种因素包括放疗、化疗、高温、电离辐射等诱导产生，其中p53、Bcl-2家族、C-myc、细胞凋亡1等基因在细胞凋亡过程中起到了重要的作用，研究强恒磁场下肿瘤细胞凋亡相关基因的变化将有利于揭示磁场抗癌作用的机理。
3.2.1 Bcl-2、Bax在细胞中的定位及分布 研究证实[6,9]，Bcl-2蛋白在细胞中主要定位于核外膜、线粒体外膜和内质网，在肿瘤标本的癌上皮中呈随机分布。本实验观察到Bcl-2染色主要定位于细胞浆，胞膜有少数染色，呈颗粒状或绕核分布，偶可均匀分布于胞浆。Bax蛋白阳性表达产物呈黄色或棕黄色，位于胞浆，少数细胞膜染色[10]。我们的实验表明Bax蛋白表达产物的定位、分布与文献结果一致。
3.2.2 磁场与Bcl-2蛋白的关系 Bcl-2是B-细胞淋巴瘤/白血病-2基因(B-cell lymphoma leukemia-2 gene)的缩写[6]。1985年Tsujimoto[7]在许多非何杰金氏B细胞淋巴瘤中发现。Bcl-2基因在调控细胞程序性死亡中具有重要意义，许多物理化学因素可以诱导细胞凋亡，Bcl-2基因的产物Bcl-2蛋白可以抑制细胞凋亡，延长细胞的生存。我们的实验结果显示，Walker-256荷瘤鼠经过恒定均匀磁场的曝磁处理后，镜下有大量的肿瘤细胞凋亡。免疫组化证实Bcl-2蛋白表达阳性率低于对照组(P<0.05)，提示磁场可以诱导细胞凋亡，并且使荷瘤鼠Bcl-2基因表达水平下调，进而说明恒定均匀磁场抑制肿瘤生长的机理是通过诱导肿瘤细胞凋亡而实现的。
3.2.3 磁场与Bax蛋白的关系 Bax是Bcl-2家族中的重要成员。研究发现，Bax基因长4.4kb，含有6个外显子，可以通过不同的剪接方式编码三种蛋白Bcl-α，β，γ。Bax基因是Bcl-2基因家族的新成员，它与Bcl-2基因有40%的同源性，但生理作用却相反。通过实验研究，我们观察到经过恒定均匀磁场处理后的荷瘤鼠肿瘤组织中Bax蛋白阳性表达率明显高于对照组。证明磁场可以作为一个凋亡发生的有效刺激因素，致使Bax基因表达增强。
3.2.4 磁场与Bcl-2/Bax比值的关系 许多研究表明[12]Bcl-2和Bax的表达程度与比值决定了细胞接受凋亡信号后的命运。在Bax基因占优势时，细胞发生凋亡；Bcl-2基因占优势时，细胞存活。本实验结果发现接受磁场作用后Bcl-2/Bax比值明显低于对照组，证明磁场可加速肿瘤细胞凋亡的发生，从而达到抑制肿瘤生长的作用。
国家自然科学基金项目(No:3950191)
参考文献
1，Pich EM, West AI.Exposure to stong static magnetic-field induces by poactivity in veaning mice[J].J Bioeletr,1991;10(1)∶50
2，Miyakoshi J,Ohtsu S, Shibta T et al.Exposure to magnetic field (5mT at 60Hz) dose not affect cell growth and c-myc gene expression[J].J Aadiat Res(Tokyo).1996;37(3)∶185
3，Jones EL,Lyons BE,Douple EB et al.Thermal enhancement of low dose rate irradiation in a murine tumor system[J].Int J Hyperthermia,1989;5(4)∶509
4，杜红文，郭佑民，张 明.磁场对小鼠S180肉瘤的抑制作用.中华理疗杂志，1992；15(2)∶80
5，刘 华，郭佑民，司履生等.强磁场对荷瘤小鼠特异性细胞毒效效应的影响.中华理疗杂志，1993；16(3)∶148
6 Reed JC.Bcl-2 and the regulation of programmed cell death[J].J Cell Biol,1994;124(1～2)∶1
7，Tsujimoto Y.Involvement of the Bcl-2 gene in human folliculer lymphoma[J].Science,1985;228(4706)∶1440
8，Vanx DL,Corgs, Adams JM.Bcl-2 gene promotes haemopioetic cell survival and cooperates with C-myc to immortalize pre-B cells[J].Nature,1988;335(6189)∶440
9，Hockenbery DM,Nunez G,Milliman C et al.Bcl-2 as an inner mitochondrial membrane protein that blocks programmed cell death[J].Nature ,1990;348(6299)334
10，Oltivai AN,Milliman CL,Korsmeyer SJ.Bcl-2 Heterodimerizes in vivo with a conserves hemology,Bax that accelerates programmed cell death[J].Cell ,1993;74(4)∶609
(1999-10-10收稿 1999-11-25修回)
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