RP-HPLC法测定人血浆中水飞蓟宾的浓度
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闫正华. 董卫华. 王茂义. 姚鸿萍.
RP-HPLC.水飞蓟宾A.水飞蓟宾B.血药浓度.
参见附件(166kb)。
作者：姚鸿萍 闫正华 董卫华 王茂义
单位：姚鸿萍(药学院1999届毕业生)；闫正华 董卫华 王茂义(西安医科大学第一附属医院药剂科 西安 710061)
关键词：RP-HPLC；水飞蓟宾A；水飞蓟宾B；血药浓度
西安医科大学学报000127摘要 建立了RP-HPLC法测定水飞蓟宾在人血浆中浓度的 方法。用乙腈沉淀血浆蛋白，离心后，取上清液10μl进样分析。色谱条件：C18 柱(10μm)220mm×4.6mm；流动相为：V(甲醇)∶V(水)∶V(0.5mol.L-1磷酸二氢 钾)=10∶10∶1(用0.2mol.L-1磷酸调pH=4.0);流速为1.0ml.min -1 ；检测波长为290nm。结果水飞蓟宾A、B平均回收率分别为98.96%、97.93%；日内RSD分 别为3.08%、2.15%；日间RSD分别为4.48%、2.64%。
中图分类号 R927.2 文献标识码 B
文章编号 0258-0659(2000)01-006 9-02
Determination of silybin in human plasma by RP-HPLC
Yan Zhe nghua, Dong Weihua, Wang Maoyi et al
(Department of Pharmacy, First Affiliated Hospital,Xian Medical University, Xi′an 710061,China)
ABSTRACT To find out a RP-HPLC method for determining silybin in human plasma with acetonitrile as protein precipitation,the concentrations o f silybin were assayed on a C18 column and detected at 290nm with a mobil e phase consisting of methanol-water -potassium dihydrogen phosphate solution (10∶10∶1) adjusted to pH=4.0 by adding phosphoric acid .The results showed th at the average recoveries were 98.96% for silybin A and 97.93% for silybin B.The i ntraday precisions were 3.08% for silybin A and 2.15% for silybin B.The interd ay precisions were 4.48% for silybin A and 2.64% for silybin B.
KEY WORDS RP-HPLC silybin A silybin B plasma concentration
水飞蓟宾是一黄酮类化合物，有两种立体异构体：水飞蓟宾A(Silybin A)、水飞蓟宾B(Sily bin B)。水飞蓟宾具改善肝功能，增强肝细胞膜的作用，其机理与抑制肿瘤坏死因子(TNF) 的产生和活性有关[1]，二者药理作用的差异未见有报道。主要用于急性、慢性肝 炎、肝硬化和代谢中毒性肝损伤等疾病[2]。我们建立了测定人血浆中水飞蓟宾浓 度的RP-HPLC法，为人体内药动学研究提供依据。
1 材料与方法
1.1 仪器 美国SP-8800液相色谱仪，Spectia 200紫外检测器 ，SP-4400积分仪，日本岛津UV-260紫外分光光度计。
1.2 试药 水飞蓟宾标准品(中国药品生物制品检定所) ，重蒸馏后甲醇(分析钝，西安化学试剂厂，批号60802)，磷酸(分析纯，北京中联化工试剂 厂，批号971102)，磷酸二氢钾( 分析纯，西安化学试剂厂，批号 960429)，乙腈(色谱纯，西安化学试剂厂，批号 980417) 。
图1 水飞蓟宾血浆色谱图
A.空白血浆 B：含水飞蓟宾标准品血液
1.水飞蓟宾A 2：水飞蓟宾B
1.3 方法
1.3.1 色谱条件 色谱柱：C18(10μm) 220mm×4.6mm;流动相为：V(甲醇)∶V(水)∶V(0.5mol。L-1磷酸二氢钾)=10∶10 ∶1(用0.2mol L-1磷酸调节pH=4.0)；检测波长290nm；流速1.0ml。min-1；纸速0.5cm。min-1， 最低检测浓度为1.80mg。L-1(信噪比为3)。血浆色谱图见图1。
1.3.2 血样的处理 精密吸取健康人空白血浆0 .2ml,置1.5ml具塞塑料试管中，精密加入0.4ml乙腈，混匀振荡1min后，12 000r。min -1离心5min，取上清液10μl进样分析。
2 结 果
2.1 标准曲线 精密称取烘干至恒重的水飞蓟宾标准品1 6.1mg，置50ml量瓶中，加甲醇溶解，并稀释至刻度，作为标准贮备液(322mg。L-1 )。再取健康人空白血浆0.2ml 8份，精密加入一定量的上述标准贮备液，使水飞蓟宾的 血浆浓度分别为2.09、3.06、4.99、9.98、19.72、30.19、49.91、80.50mg。L -1。按方法中3.2操作，以峰面积A对浓度C作线性回归得标准曲线，水飞蓟宾A：A =232 81C-3715(r=0.9998);水飞蓟宾B：A=26117C-14915(r=0.9996)。可知水飞蓟宾A、B在 2.09～80.50mg。L-1范围内呈良好的线性关系。
表1 方法精密度测定结果(n=3) 浓度
(mg。L-1)
水飞蓟宾A(%)
水飞蓟宾B(%)
日内RSD
日间RSD
日内RSD
日间RSD
4.99
5.52
7.65
3.04
1.25
49.91
3.14
1.32
1.39
4.48
80.50
0.57
2.68
2.03
2.20
3.08
4.48
2.15
2.64
2.2 方法精密度及回收率 取健康人空白血浆0. 2ml，精密加入一定量的水飞蓟宾标准贮备液，使水飞蓟宾的血浆浓度分别为4.99、49.91 、80.50mg。L-1。按方法3.2中操作，考察日内和日间精密度及方法回收率，结 果见表1、表2。表2 回收率测定结果(n=3) 浓度
(mg。L-1)
水飞蓟宾A(%)
水飞蓟宾B(%)
回收率
R SD
回收率
RSD
4.99
101.17
5.52
102.33
3.04
49.91
92.32
3.14
90.09
1.39
80.50
103.38
0.57
103.88
2.03
98.96
3.08
97.93
2.15
3 讨 论
3.1 处理血浆样品时，曾选用甲醇作为蛋白沉淀剂，甲醇用量大 、蛋白沉淀不完全；后选用乙腈,除蛋白效果好、用量少，且可直接进样。
3.2 曾用不同比例的甲醇-水(pH>7)为流动相，水飞蓟宾色谱峰与溶剂 峰重叠。因为水飞蓟宾A、B解离，与固定相的亲和力降低，改用V(水)∶V(甲醇)∶V(0.5mo l 。L-1磷酸二氢钾)=10∶10∶1(pH=4.0)作为流动相[3]，水飞蓟宾A、B 在18～20min之间出峰，二者能够完全分离，峰形也较好。
陕西省科学技术研究发展计划项目(97K12-G22)
参考文献
1.张俊平，胡振林，冯增辉.水飞蓟素对小鼠肝脏炎症损伤和肿瘤坏 死因子的产生及活性的影响[J].药学学报，1996；31(8)∶577
2.Skottora,Krecman V.Silymarin as a potential hypolestrolemic drug phys iol[J].Research (prague).1998;47(1)∶1
3.王萍，丛滋润，王俊德等.水飞蓟宾中活性黄酮的测定[J].色谱，1998 ；16(6)∶510
(1999-06-22收稿 1999-07-16修回)
作者：姚鸿萍 闫正华 董卫华 王茂义
单位：姚鸿萍(药学院1999届毕业生)；闫正华 董卫华 王茂义(西安医科大学第一附属医院药剂科 西安 710061)
关键词：RP-HPLC；水飞蓟宾A；水飞蓟宾B；血药浓度
西安医科大学学报000127摘要 建立了RP-HPLC法测定水飞蓟宾在人血浆中浓度的 方法。用乙腈沉淀血浆蛋白，离心后，取上清液10μl进样分析。色谱条件：C18 柱(10μm)220mm×4.6mm；流动相为：V(甲醇)∶V(水)∶V(0.5mol.L-1磷酸二氢 钾)=10∶10∶1(用0.2mol.L-1磷酸调pH=4.0);流速为1.0ml.min -1 ；检测波长为290nm。结果水飞蓟宾A、B平均回收率分别为98.96%、97.93%；日内RSD分 别为3.08%、2.15%；日间RSD分别为4.48%、2.64%。
中图分类号 R927.2 文献标识码 B
文章编号 0258-0659(2000)01-006 9-02
Determination of silybin in human plasma by RP-HPLC
Yan Zhe nghua, Dong Weihua, Wang Maoyi et al
(Department of Pharmacy, First Affiliated Hospital,Xian Medical University, Xi′an 710061,China)
ABSTRACT To find out a RP-HPLC method for determining silybin in human plasma with acetonitrile as protein precipitation,the concentrations o f silybin were assayed on a C18 column and detected at 290nm with a mobil e phase consisting of methanol-water -potassium dihydrogen phosphate solution (10∶10∶1) adjusted to pH=4.0 by adding phosphoric acid .The results showed th at the average recoveries were 98.96% for silybin A and 97.93% for silybin B.The i ntraday precisions were 3.08% for silybin A and 2.15% for silybin B.The interd ay precisions were 4.48% for silybin A and 2.64% for silybin B.
KEY WORDS RP-HPLC silybin A silybin B plasma concentration
水飞蓟宾是一黄酮类化合物，有两种立体异构体：水飞蓟宾A(Silybin A)、水飞蓟宾B(Sily bin B)。水飞蓟宾具改善肝功能，增强肝细胞膜的作用，其机理与抑制肿瘤坏死因子(TNF) 的产生和活性有关[1]，二者药理作用的差异未见有报道。主要用于急性、慢性肝 炎、肝硬化和代谢中毒性肝损伤等疾病[2]。我们建立了测定人血浆中水飞蓟宾浓 度的RP-HPLC法，为人体内药动学研究提供依据。
1 材料与方法
1.1 仪器 美国SP-8800液相色谱仪，Spectia 200紫外检测器 ，SP-4400积分仪，日本岛津UV-260紫外分光光度计。
1.2 试药 水飞蓟宾标准品(中国药品生物制品检定所) ，重蒸馏后甲醇(分析钝，西安化学试剂厂，批号60802)，磷酸(分析纯，北京中联化工试剂 厂，批号971102)，磷酸二氢钾( 分析纯，西安化学试剂厂，批号 960429)，乙腈(色谱纯，西安化学试剂厂，批号 980417) 。
图1 水飞蓟宾血浆色谱图
A.空白血浆 B：含水飞蓟宾标准品血液
1.水飞蓟宾A 2：水飞蓟宾B
1.3 方法
1.3.1 色谱条件 色谱柱：C18(10μm) 220mm×4.6mm;流动相为：V(甲醇)∶V(水)∶V(0.5mol。L-1磷酸二氢钾)=10∶10 ∶1(用0.2mol L-1磷酸调节pH=4.0)；检测波长290nm；流速1.0ml。min-1；纸速0.5cm。min-1， 最低检测浓度为1.80mg。L-1(信噪比为3)。血浆色谱图见图1。
1.3.2 血样的处理 精密吸取健康人空白血浆0 .2ml,置1.5ml具塞塑料试管中，精密加入0.4ml乙腈，混匀振荡1min后，12 000r。min -1离心5min，取上清液10μl进样分析。
2 结 果
2.1 标准曲线 精密称取烘干至恒重的水飞蓟宾标准品1 6.1mg，置50ml量瓶中，加甲醇溶解，并稀释至刻度，作为标准贮备液(322mg。L-1 )。再取健康人空白血浆0.2ml 8份，精密加入一定量的上述标准贮备液，使水飞蓟宾的 血浆浓度分别为2.09、3.06、4.99、9.98、19.72、30.19、49.91、80.50mg。L -1。按方法中3.2操作，以峰面积A对浓度C作线性回归得标准曲线，水飞蓟宾A：A =232 81C-3715(r=0.9998);水飞蓟宾B：A=26117C-14915(r=0.9996)。可知水飞蓟宾A、B在 2.09～80.50mg。L-1范围内呈良好的线性关系。
表1 方法精密度测定结果(n=3) 浓度
(mg。L-1)
水飞蓟宾A(%)
水飞蓟宾B(%)
日内RSD
日间RSD
日内RSD
日间RSD
4.99
5.52
7.65
3.04
1.25
49.91
3.14
1.32
1.39
4.48
80.50
0.57
2.68
2.03
2.20
3.08
4.48
2.15
2.64
2.2 方法精密度及回收率 取健康人空白血浆0. 2ml，精密加入一定量的水飞蓟宾标准贮备液，使水飞蓟宾的血浆浓度分别为4.99、49.91 、80.50mg。L-1。按方法3.2中操作，考察日内和日间精密度及方法回收率，结 果见表1、表2。表2 回收率测定结果(n=3) 浓度
(mg。L-1)
水飞蓟宾A(%)
水飞蓟宾B(%)
回收率
R SD
回收率
RSD
4.99
101.17
5.52
102.33
3.04
49.91
92.32
3.14
90.09
1.39
80.50
103.38
0.57
103.88
2.03
98.96
3.08
97.93
2.15
3 讨 论
3.1 处理血浆样品时，曾选用甲醇作为蛋白沉淀剂，甲醇用量大 、蛋白沉淀不完全；后选用乙腈,除蛋白效果好、用量少，且可直接进样。
3.2 曾用不同比例的甲醇-水(pH>7)为流动相，水飞蓟宾色谱峰与溶剂 峰重叠。因为水飞蓟宾A、B解离，与固定相的亲和力降低，改用V(水)∶V(甲醇)∶V(0.5mo l 。L-1磷酸二氢钾)=10∶10∶1(pH=4.0)作为流动相[3]，水飞蓟宾A、B 在18～20min之间出峰，二者能够完全分离，峰形也较好。
陕西省科学技术研究发展计划项目(97K12-G22)
参考文献
1.张俊平，胡振林，冯增辉.水飞蓟素对小鼠肝脏炎症损伤和肿瘤坏 死因子的产生及活性的影响[J].药学学报，1996；31(8)∶577
2.Skottora,Krecman V.Silymarin as a potential hypolestrolemic drug phys iol[J].Research (prague).1998;47(1)∶1
3.王萍，丛滋润，王俊德等.水飞蓟宾中活性黄酮的测定[J].色谱，1998 ；16(6)∶510
(1999-06-22收稿 1999-07-16修回)
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