益气养血保元方对肺癌细胞PCNA、p53蛋白表达的影响
http://www.100md.com
周冬枝. 陈葳. 刘永惠. 邓景元.
补肾益气法.益气养血保元胶囊.肺腺癌细胞.PCNA.p53蛋白.
参见附件(185kb)。
作者：周冬枝 陈葳 刘永惠 邓景元
单位：(西安医科大学第一临床医学院中医科 西安 710061)
关键词：补肾益气法；益气养血保元胶囊；肺腺癌细胞；PCNA；p53蛋白
西安医科大学学报000108 摘要 采用免疫组化法观察益气养血保元胶囊(OQP)对体外 培养人肺癌A-549细胞PCNA、p53蛋白异常表达的影响。结果：OQP作用后A -549细胞PCNA、p53蛋白表达减弱。提示：OQP可抑制PCNA、p53蛋白表达， 其抑癌作用机理可能与抑制PCNA、p53蛋白表达有关。
中图分类号 R273 文献标识码 A
文章编号 0258-0659(2000)01-0022- 02
The influence of the prescription of the reinforcing Qi and enriching blood for keeping the original Qi to the expression for PCNA,p53 protein in the cell of lung cancer
Zhou Dongzhi, Chen Wei ,Liu Yonghui et al
(Department of The Traditional Chinese Medical，First Affiliated Hospital, Xi ′an Medical University, Xi′an 710061,China)
ABSTRACT In order to discuss the functionary mechanism of the prescription of the reinforcing Qi and enriching kideny-prescription of reinfor c ing Qi and enriching blood for keeping the original Qi(OQP) for treating the lun g cancer, the immunochemical method was used to observe the influence for OQP to the abnormal expression for PCNA、protein p53 in the unorganized cell of lung c ancer which was cultured previously.The results showed that the expression for P N CA、protein p53 in the cell of A-549 is reduced after the action of OQP.It prom p ts that OQP may restrain the expression for PNCA、protein p53.The functionary me chanism for its restraining cancer may be relative to its restraining the expres sion for PCAN、protein p53.
KEY WORDS method of reinforcing Qi and enriching kidney capsule of reinforcing Qi and enriching blood for keeping the Original Qi the cell of t he lung adenocarcinoma PCNA protein p53
中药是肺癌综合治疗重要手段。张玉五教授根据“养正积自除”理论，在多年临床实践基 础上，采用补肾益气法，研制了益气养血保元胶囊(Precription of the Reinforcing Qi and Enriching Blood for Keeping the Original Qi,OQP)，临床观察对肺癌有显著疗效。 为探 讨其疗效机理，本研究观察了该方对体外培养人肺癌A-549细胞PCNA(增殖细胞核抗原)、p5 3蛋白异常表达的影响。
1 材料与方法
1.1 材料 ①细胞株：A-549是一贴壁生长、可持续传代的人肺 腺癌细胞株，由第一临床医学院分子中心提供。②培养基：RPMI1640培养液(Gibco产品)， 加10%小牛血清，青、链霉素各100U/ml。③试剂：免疫组化第一抗体鼠抗人PCNA、p53及LS AB试剂盒为Dako公司产品。④中药制备：益气养血保元方由沙苑子、女贞子、枸杞子、黄芪 、丹参等组成。经水煎、醇提、浓缩备用。由西安医科大学药学系制备。
1.2 方法 将5×105/ml处于对数生长期的A-549细 胞接种至盖玻片上，37℃ 5%CO2培养箱中培养，24h后分别加入25mg/L和50mg/L的OQP，培 养24、48h后固定染色。
免疫组化：生长在盖玻片上的细胞经3个梯度酒精(100%、95%、80%)至水，放入3%甲醇双氧 水混合液20min。放入枸椽酸缓冲液(pH 6.0)，置微波炉中5min×2次。加封闭血清。抖去血 清，滴加一抗PCNA(1∶100)、p53(1∶40)，室温下孵育2h。滴加第二抗体，室温孵育1h 。以上步骤均经PBS液洗涤3次，每次5min。放入新配置的DAB-H2O2中(PBS缓冲液10 0ml+DAB 50mg+3%H2O2 0.1ml+二甲基亚砜1ml)显色10～15min。自来水中止反应，脱水、透明、封片。
1.3 结果判定 光镜观察：PCNA及p53以细胞核染成黄色 至棕黄色为阳性细胞，用低倍镜选择三个背景最清楚，DAB显色对比最满意的区域，再换高 倍镜分别计算每500个细胞中阳性细胞的数量。取这三个区域阳性细胞的平均数作为阳性率 。PCNA：弱阳性(+)<25%;强阳性(
)>70%;中度阳性(
)位于两者之间。p53：弱阳性(+)<10 %;强阳性()>60%～70%；中度阳性()，位于两者之间。
2 结 果
PCNA及p53蛋白免疫反应局限于细胞核内，胞浆中没有，细胞核染成黄色至棕黄色。空白对 照组PCNA表达呈强阳性()(见图1)。加入OQP25mg/L，24h及48h PCNA略有变化但不明显。 加入OQP 50mg/L，24h PCNA表达减弱()(见图2)。空白对照组p53蛋白表达阳性()(见图3 )。加入OQP 25mg/L， 24h及48h p53蛋白表达无明显变化。加入OQP 50mg/L， 24h p53蛋白 表 达为弱阳性(+)(见图4)。加入OQP 50mg/L ，48h细胞大部分死亡，PCNA及p53无法分析。
表1 OQP不同浓度、不同时间对A-549细胞PCAN、p53蛋白表达强度的影响 组别
PCNA
p53
24h
48h
24h
48h
对 照 组
OQP25mg/L组
OQP 50mg/L组
细胞大部
分死亡
+
细胞大部
分死亡)
图1 细胞核染成棕色，阳性细胞密集
PCAN() LSBA×200
图2 细胞核染成黄色至黄棕色PCNA() LSAB×200
图3 细胞核染成黄棕色p53() LSAB×200
图4 细胞核染成淡黄色，阳性细胞分散
p53(+) LSAB×200
3 讨 论
PCNA是一种反应细胞周期在特定细胞核内表达一定特异抗原的相关蛋白[1] 。它的出现明显与细胞增殖有关，在静止细胞其量很少；在增殖细胞，G1晚期开始增加， S期合成达到高峰，G2/M期明显下降。它是DNA复制的必需物质，能较好的预示肿瘤生物学 行为，文献报道在肺、肝、肾等人体肿瘤中表达有重要意义。本研究表明，空白对照组PCNA 呈阳性表达()，说明肺腺癌A-549细胞增殖高度活跃。经OQP作用后，PCAN表达减弱() ，提示在OQP的影响下，PCNA对A-549细胞的增殖效应受到一定程度的抑制。
肿瘤发生的根本原因是基因改变-癌基因的激活及抑癌基因的失活。癌基因以功能激活方式 致癌，抑癌基因则以功能失活方式参与致癌过程。野生型p53基因是一种抑癌基因，具有控 制细胞增殖和转化作用，通过抑制细胞周期从G0期进入S期来调节细胞增殖，促进细胞终 未分化和程序化死亡过程起到“基因卫士”的作用[3，4]。突变型p53基因则丧 失了抑癌功能，促进细胞转化与过度增殖导致肿瘤形成[5]。文献报道中药对肿瘤 发生发展阻断作用机理：一是药物直接抑制癌细胞生长，二是通过调节人体免疫系统功能， 抑制或杀伤癌细胞。我们曾采用MTT法及流式细胞术，分析对体外培养肺癌A-549细胞生长 的影响，证明该方对细胞周期有干扰作用[2]。本研究发现，空白对照组p53蛋白 呈阳性表达()，说明人肺癌A-549细胞增殖与p53蛋白过度表达有关。经OQP作用后，p53 蛋白异常表达减弱(+)，说明该方抑癌机理可能与抑制p53蛋白异常表达有关。
在实验中还观察到，OQP对肿瘤细胞的影响呈现出时间-效应关系。加入OQP 50mg/L， 24h 表 现对肿瘤基因物质的影响，48h则导致细胞大部分死亡。提示OQP在更宽广的范围可能影响细 胞存活，这种对癌细胞的致死性损害，如果对正常细胞也出现同样的影响，说明该药对细胞 的作用没有体内正常细胞和异常细胞的差异；如果仅表现在对肿瘤细胞的伤害作用，而不表 现对正常细胞具有这种伤害，这将有着极大的理论和临床意义，人们所追求的高效低毒抗肿 瘤药物就是这个含义。
肺癌属中医“肺积”范畴，其发生的根本原因是正气不足，《医宗必读》曰：“积之成也， 正气不足，而后邪气居之。”临床观察肺癌患者均有程度不同的乏力、气短、心悸等虚证表 现。OQP方中以黄芪、人参补气固本，沙苑子、枸杞子之属补肾填精，临床观察可在整 体 水平改善患者虚证症状，提高患者生存质量。笔者认为，无论肿瘤患者是否有虚证表现，都 存在特有的本质上的正虚，即对周围环境存在的致癌因素异常敏感，不能承受致癌因素的攻 击而发生抑制癌基因突变或癌基因过度扩增，致使肿瘤形成；肿瘤的形成，又使正虚进一步 加重。OQP能使基因异常表达减弱，正邪实力相互转换，说明有治疗虚弱本质的特有作用， 提示扶正中药具治疗恶性肿瘤潜能的同时，也说明“邪之所凑，其气必虚”，“养正积自 除”理论的正确性。
陕西省自然科学基金资助课题(97sm39)
参考文献
1.Jaskulski D, Deriel JK,Mercher et al.Inhibition of cell uar proliferation by antisense oligodeoxynuleotides to PCNA/cyclin[J].Science, 19 88;240∶1544
2.陈葳，程小丽，周冬枝等.益气养血保元方对体外培养人肺癌细胞增殖的影响 [J].中国中医基础研究杂志，1999；5(6)∶23
3.Lane Dp.A Death in the Life of p53[J].Nature, 1993;362(6423)∶786
4.Lane Dp.p53,guardian of the Genome[J].Nature, 1992;358(6381)∶15～16
5.刘鸿君.p53基因突变与致癌作用[J].国外医学卫生学分册，1996；23(2)∶3 9
(1999-06-27收稿 1999-09-01修回)
作者：周冬枝 陈葳 刘永惠 邓景元
单位：(西安医科大学第一临床医学院中医科 西安 710061)
关键词：补肾益气法；益气养血保元胶囊；肺腺癌细胞；PCNA；p53蛋白
西安医科大学学报000108 摘要 采用免疫组化法观察益气养血保元胶囊(OQP)对体外 培养人肺癌A-549细胞PCNA、p53蛋白异常表达的影响。结果：OQP作用后A -549细胞PCNA、p53蛋白表达减弱。提示：OQP可抑制PCNA、p53蛋白表达， 其抑癌作用机理可能与抑制PCNA、p53蛋白表达有关。
中图分类号 R273 文献标识码 A
文章编号 0258-0659(2000)01-0022- 02
The influence of the prescription of the reinforcing Qi and enriching blood for keeping the original Qi to the expression for PCNA,p53 protein in the cell of lung cancer
Zhou Dongzhi, Chen Wei ,Liu Yonghui et al
(Department of The Traditional Chinese Medical，First Affiliated Hospital, Xi ′an Medical University, Xi′an 710061,China)
ABSTRACT In order to discuss the functionary mechanism of the prescription of the reinforcing Qi and enriching kideny-prescription of reinfor c ing Qi and enriching blood for keeping the original Qi(OQP) for treating the lun g cancer, the immunochemical method was used to observe the influence for OQP to the abnormal expression for PCNA、protein p53 in the unorganized cell of lung c ancer which was cultured previously.The results showed that the expression for P N CA、protein p53 in the cell of A-549 is reduced after the action of OQP.It prom p ts that OQP may restrain the expression for PNCA、protein p53.The functionary me chanism for its restraining cancer may be relative to its restraining the expres sion for PCAN、protein p53.
KEY WORDS method of reinforcing Qi and enriching kidney capsule of reinforcing Qi and enriching blood for keeping the Original Qi the cell of t he lung adenocarcinoma PCNA protein p53
中药是肺癌综合治疗重要手段。张玉五教授根据“养正积自除”理论，在多年临床实践基 础上，采用补肾益气法，研制了益气养血保元胶囊(Precription of the Reinforcing Qi and Enriching Blood for Keeping the Original Qi,OQP)，临床观察对肺癌有显著疗效。 为探 讨其疗效机理，本研究观察了该方对体外培养人肺癌A-549细胞PCNA(增殖细胞核抗原)、p5 3蛋白异常表达的影响。
1 材料与方法
1.1 材料 ①细胞株：A-549是一贴壁生长、可持续传代的人肺 腺癌细胞株，由第一临床医学院分子中心提供。②培养基：RPMI1640培养液(Gibco产品)， 加10%小牛血清，青、链霉素各100U/ml。③试剂：免疫组化第一抗体鼠抗人PCNA、p53及LS AB试剂盒为Dako公司产品。④中药制备：益气养血保元方由沙苑子、女贞子、枸杞子、黄芪 、丹参等组成。经水煎、醇提、浓缩备用。由西安医科大学药学系制备。
1.2 方法 将5×105/ml处于对数生长期的A-549细 胞接种至盖玻片上，37℃ 5%CO2培养箱中培养，24h后分别加入25mg/L和50mg/L的OQP，培 养24、48h后固定染色。
免疫组化：生长在盖玻片上的细胞经3个梯度酒精(100%、95%、80%)至水，放入3%甲醇双氧 水混合液20min。放入枸椽酸缓冲液(pH 6.0)，置微波炉中5min×2次。加封闭血清。抖去血 清，滴加一抗PCNA(1∶100)、p53(1∶40)，室温下孵育2h。滴加第二抗体，室温孵育1h 。以上步骤均经PBS液洗涤3次，每次5min。放入新配置的DAB-H2O2中(PBS缓冲液10 0ml+DAB 50mg+3%H2O2 0.1ml+二甲基亚砜1ml)显色10～15min。自来水中止反应，脱水、透明、封片。
1.3 结果判定 光镜观察：PCNA及p53以细胞核染成黄色 至棕黄色为阳性细胞，用低倍镜选择三个背景最清楚，DAB显色对比最满意的区域，再换高 倍镜分别计算每500个细胞中阳性细胞的数量。取这三个区域阳性细胞的平均数作为阳性率 。PCNA：弱阳性(+)<25%;强阳性(
)>70%;中度阳性()位于两者之间。p53：弱阳性(+)<10 %;强阳性()>60%～70%；中度阳性()，位于两者之间。2 结 果
PCNA及p53蛋白免疫反应局限于细胞核内，胞浆中没有，细胞核染成黄色至棕黄色。空白对 照组PCNA表达呈强阳性(
)(见图1)。加入OQP25mg/L，24h及48h PCNA略有变化但不明显。 加入OQP 50mg/L，24h PCNA表达减弱()(见图2)。空白对照组p53蛋白表达阳性()(见图3 )。加入OQP 25mg/L， 24h及48h p53蛋白表达无明显变化。加入OQP 50mg/L， 24h p53蛋白 表 达为弱阳性(+)(见图4)。加入OQP 50mg/L ，48h细胞大部分死亡，PCNA及p53无法分析。表1 OQP不同浓度、不同时间对A-549细胞PCAN、p53蛋白表达强度的影响 组别
PCNA
p53
24h
48h
24h
48h
对 照 组
OQP25mg/L组
OQP 50mg/L组
细胞大部
分死亡
+
细胞大部
分死亡)
图1 细胞核染成棕色，阳性细胞密集
PCAN(
) LSBA×200图2 细胞核染成黄色至黄棕色PCNA(
) LSAB×200图3 细胞核染成黄棕色p53(
) LSAB×200图4 细胞核染成淡黄色，阳性细胞分散
p53(+) LSAB×200
3 讨 论
PCNA是一种反应细胞周期在特定细胞核内表达一定特异抗原的相关蛋白[1] 。它的出现明显与细胞增殖有关，在静止细胞其量很少；在增殖细胞，G1晚期开始增加， S期合成达到高峰，G2/M期明显下降。它是DNA复制的必需物质，能较好的预示肿瘤生物学 行为，文献报道在肺、肝、肾等人体肿瘤中表达有重要意义。本研究表明，空白对照组PCNA 呈阳性表达(
)，说明肺腺癌A-549细胞增殖高度活跃。经OQP作用后，PCAN表达减弱() ，提示在OQP的影响下，PCNA对A-549细胞的增殖效应受到一定程度的抑制。肿瘤发生的根本原因是基因改变-癌基因的激活及抑癌基因的失活。癌基因以功能激活方式 致癌，抑癌基因则以功能失活方式参与致癌过程。野生型p53基因是一种抑癌基因，具有控 制细胞增殖和转化作用，通过抑制细胞周期从G0期进入S期来调节细胞增殖，促进细胞终 未分化和程序化死亡过程起到“基因卫士”的作用[3，4]。突变型p53基因则丧 失了抑癌功能，促进细胞转化与过度增殖导致肿瘤形成[5]。文献报道中药对肿瘤 发生发展阻断作用机理：一是药物直接抑制癌细胞生长，二是通过调节人体免疫系统功能， 抑制或杀伤癌细胞。我们曾采用MTT法及流式细胞术，分析对体外培养肺癌A-549细胞生长 的影响，证明该方对细胞周期有干扰作用[2]。本研究发现，空白对照组p53蛋白 呈阳性表达(
)，说明人肺癌A-549细胞增殖与p53蛋白过度表达有关。经OQP作用后，p53 蛋白异常表达减弱(+)，说明该方抑癌机理可能与抑制p53蛋白异常表达有关。在实验中还观察到，OQP对肿瘤细胞的影响呈现出时间-效应关系。加入OQP 50mg/L， 24h 表 现对肿瘤基因物质的影响，48h则导致细胞大部分死亡。提示OQP在更宽广的范围可能影响细 胞存活，这种对癌细胞的致死性损害，如果对正常细胞也出现同样的影响，说明该药对细胞 的作用没有体内正常细胞和异常细胞的差异；如果仅表现在对肿瘤细胞的伤害作用，而不表 现对正常细胞具有这种伤害，这将有着极大的理论和临床意义，人们所追求的高效低毒抗肿 瘤药物就是这个含义。
肺癌属中医“肺积”范畴，其发生的根本原因是正气不足，《医宗必读》曰：“积之成也， 正气不足，而后邪气居之。”临床观察肺癌患者均有程度不同的乏力、气短、心悸等虚证表 现。OQP方中以黄芪、人参补气固本，沙苑子、枸杞子之属补肾填精，临床观察可在整 体 水平改善患者虚证症状，提高患者生存质量。笔者认为，无论肿瘤患者是否有虚证表现，都 存在特有的本质上的正虚，即对周围环境存在的致癌因素异常敏感，不能承受致癌因素的攻 击而发生抑制癌基因突变或癌基因过度扩增，致使肿瘤形成；肿瘤的形成，又使正虚进一步 加重。OQP能使基因异常表达减弱，正邪实力相互转换，说明有治疗虚弱本质的特有作用， 提示扶正中药具治疗恶性肿瘤潜能的同时，也说明“邪之所凑，其气必虚”，“养正积自 除”理论的正确性。
陕西省自然科学基金资助课题(97sm39)
参考文献
1.Jaskulski D, Deriel JK,Mercher et al.Inhibition of cell uar proliferation by antisense oligodeoxynuleotides to PCNA/cyclin[J].Science, 19 88;240∶1544
2.陈葳，程小丽，周冬枝等.益气养血保元方对体外培养人肺癌细胞增殖的影响 [J].中国中医基础研究杂志，1999；5(6)∶23
3.Lane Dp.A Death in the Life of p53[J].Nature, 1993;362(6423)∶786
4.Lane Dp.p53,guardian of the Genome[J].Nature, 1992;358(6381)∶15～16
5.刘鸿君.p53基因突变与致癌作用[J].国外医学卫生学分册，1996；23(2)∶3 9
(1999-06-27收稿 1999-09-01修回)
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