滋养细胞疾病和妊娠绒毛组织中端粒酶的表达
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张忠明. 岩坂刚. 司履生!基础医学
端粒酶.滋养细胞疾病.妊娠绒毛.肿瘤形成.
参见附件(172kb)。
作者：张忠明 岩坂刚 司履生 郑鹏生 杉森甫 张蕴景
单位：(西安医科大学第一附属医院妇产科 西安 710061)
关键词：端粒酶；滋养细胞疾病；妊娠绒毛；肿瘤形成
西安医科大学学报000225摘要 目的 明确妊娠滋养细胞疾病和正常绒毛组织中的端粒酶表达状况，探索端粒酶活化在滋养细胞肿瘤形成中的作用。方法 应用以聚合酶链反应为基础的端粒酶测定方法(TRAP)，对不同临床类型妊娠滋养细胞疾病及不同发育阶段正常妊娠绒毛组织共61例的端粒酶活性进行检测。结果 绒毛膜癌及侵蚀性葡萄胎36.4%(4/11)端粒酶阳性，葡萄胎26.3%(5/19)阳性；早孕60d以内绒毛全部(10/10)阳性，此期以后的胎盘组织(21/21)阴性。结论 端粒酶在妊娠早期以后表达受到抑制，其活化在滋养细胞肿瘤形成中可能起重要作用；其测定对此类疾病的诊断、预后和疗效评定有潜在价值。
中图分类号 R737.33 文献标识码 A 文章编号 0258-0659(2000)02-0160-03
Telomerase expression in tissues of gestational trophoblastic diseases and normal chorionic villi
Zhang Zhongming Tsuyoshi Iwasaka Si Lüsheng
(Department of Obstetrics & Gynecology, First Affiliated Hospital, Xi′an Medical University, Xi′an 710061，China)
ABSTRACT Objective To investigate the prevalence of telomerase expression in gestational trophoblastic diseases and chorionic villi, and to evaluate the role of telomerase activation in tumorigenesis of tropholbastic tumors.Methods The telomeric repeat amplification protocol (TRAP) assay was used to detect telomerase activity in 61 samples from a variety of gestational tropholbastic tumors and different developing periods of normal chorionic villi.Results Telomerase activity was found in 36.4%(4/11) of gestational trophoblastic tumors (including choriocarcinomas and invasive moles),26.3%(5/19) of hydatidiform moles and 100%(10/10) of early embryonic villi, but was negative in the 21 cases of normal chorionic villi after 60 d of pregnancy .Conclusion Telomerase is expressed in the villi during very early embryonic period, but is repressed after the completion of organogenesis.Telomerase activation may play an important role in the tumorigenesis of trophoblastic tumors.Detection of telomerase activity has some potential value in differential diagnosis, prognosis and chemotherapeutic effect evaluation of these diseases.
KEY WORDS telomerase trophoblastic diseases chorionic villi tumorigenesis
端粒酶 (Telomerase) 是一种特殊的逆转录酶， 可以其RNA为模板合成端粒重复构件，使随细胞增殖而缩短的端粒长度不再短缩， 引起细胞的永生化[1，2]。 人类大部分体细胞没有可检测的端粒酶活性，恶性肿瘤细胞则相反[2]。 滋养细胞肿瘤是一类组织来源和生物行为明显不同于其他的特殊肿瘤[3]，本研究通过对妊娠滋养细胞疾病和正常妊娠绒毛组织中端粒酶活性的检测，探索端粒酶活化在此类肿瘤形成中的作用以及对其检测的临床价值。
1 材料和方法
1.1 病例及组织标本 病例选自1996 年10 月至1999 年3月在西安医科大学和佐贺医科大学附属医院被临床诊断的患者及终止妊娠孕妇共61例，年龄18～43岁(平均28岁)。其中绒毛膜癌5例、侵蚀性葡萄胎6例，孕6～23周葡萄胎19例；32d至43周妊娠31例。取清宫术或手术切除病变组织和人工流产或分娩后绒毛组织每例约10～200mg，迅速液氮冻存。1.2 方法 端粒酶活性测定根据Kim[2]报道的TRAP(Telomeric repeat amplification protocol)方法进行。主要步骤为：①组织端粒酶提取：前述冻存组织在4℃下经清洗、悬浮，CHAPS溶解液冷浴裂解，-80℃冻存。②端粒重复序列延伸，2μl端粒酶提取物加入43μl反应液中(含0.2μg TS引物[5′-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3′]、dNTPs及[α-32P]dCTP和[α-32P]dTTP,室温30min。③端粒酶失活处理。④PCR循环：反应体系中加入含0.1μg CX引物(5′-CCCTTACCCTTACCCTTACCCTAA-3′)和2U Taq DNA聚合酶的扩增液5μl。94℃变性处理3min后经94℃变性54s,50℃退火45s,72℃延伸60s共30个循环。⑤电泳及放射自显影。详细步骤见参考文献[4]。
1.3 统计学方法 组间比较用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 妊娠滋养细胞肿瘤组 11例临床Ⅰ～Ⅲa期恶性肿瘤滋养细胞肿瘤经0～12标准疗程化疗后因多种临床指征手术的病变组织中，4例(绒癌及侵蚀性葡萄胎各2例)端粒酶阳性。阳性病例为临床Ⅰ～Ⅱa期及化疗0～5个疗程者(占Ⅰ～Ⅱa期病例的4/9；0～5疗程化疗的4/6),Ⅱb、Ⅲa期(2例)及6个以上疗程(5例)者均为阴性。端粒酶阳性率在不同临床期别、疗程数间比较，无统计学差异。
附表 滋养细胞疾病和妊娠绒毛端粒酶检测结果及比较 组织类型
总例数
阳性例数
阳性率(比)
滋养细胞肿瘤
11
4
36.4%
绒毛膜癌
5
2
2/5
侵蚀性葡萄胎
6
2
2/6
葡萄胎
19
5
26.3%
妊娠绒毛
31
10
32.3%
<60d
10
10
100%
>60d
21
0
0
滋养细胞肿瘤、葡萄胎和妊娠绒毛各组间的比较P>0.05
60d以内绒毛与其他各组间的比较P<0.05
2.2 葡萄胎组 19例中5例端粒酶阳性。按病理学分级，滋养细胞轻、中、重度增生活跃端粒酶阳性比分别为2/10、2/6和1/3，差异无统计学意义。阳性病例中，2例随诊6和8周后恶变。
2.3 妊娠绒毛组 10例60d以内早孕绒毛端粒酶全部阳性，此期以后者阴性。
以上各组端粒酶活性检测结果及比较见附表。
3 讨 论
端粒酶在人类绝大多数正常体细胞中缺乏表达而在生殖干细胞中例外[5]。妊娠滋养细胞与胚胎组织细胞同源于生殖细胞，在早早孕阶段胚胎分化尚待开始，生物特性相似[3，5]。本研究中从早孕32d(种植仅数天)到60d以内绒毛组织端粒酶全部阳性而此期以后阴性，与文献报道结果基本一致[5～7]。说明从生殖细胞起端粒酶即以表达形式延续至早孕早期，其作用可能与其在生殖干细胞中的作用类似，与保证生物特性的精确遗传有关。由于早孕60d以内正是胚胎发育中从无定向性的幼稚干细胞到定向发育开始的时期，此期端粒酶的表达可能反映了细胞的增殖活跃而分化不足。随着定向分化的完成，端粒酶表达受到抑制而呈阴性。至于端粒酶表达的抑制是胚胎组织分化的原因还是结果尚需进一步探讨。
端粒酶活性是恶性肿瘤的普遍现象，其在肿瘤形成中的作用与其活化而引发的细胞永生化有关，因为端粒酶表达与细胞永生化是伴行的[2，4，6，8]，而永生化是细胞恶变的必经步骤。妊娠滋养细胞肿瘤是一类来源于妊娠滋养细胞而非源自体细胞的特殊肿瘤。滋养细胞本身既有许多与肿瘤细胞相似的生物学特性，即在妊娠早中期有侵蚀性，但以后得到抑制，滋养细胞肿瘤的形成正与这种抑制的不足或解除有关[3]。由于本研究中的肿瘤病例多经接近临床治愈的化疗，加之标本中血液成分对端粒酶抑制的可能，虽然仅有4例端粒酶阳性，阳性率明显低于文献报道的在其他肿瘤和滋养细胞肿瘤中85%～100%的检测结果[2，4，8，9]，但在治疗前病变中的端粒酶普遍表达的可能性极大。阳性病例中1例原诊断为绒癌I期第一疗程化疗未及完成即突发子宫穿孔行急症手术以及另3例化疗次数明显少于该组平均化疗次数的事实，对以上推论是个佐证。由端粒酶在妊娠早期绒毛中阳性，以后转阴，部分葡萄胎和滋养细胞肿瘤中再度阳性，且渐多表达的变化过程可以看出，端粒酶的活性与滋养细胞的幼稚性、增殖活跃和侵蚀性是相一致的，其活化在滋养细胞肿瘤形成中可能起重要作用。
虽然TRAP方法有很高的敏感度[2，4]，但由于取材的困难，目前在滋养肿瘤细胞 诊断 上还少有临床价值。本研究中大多数充分化疗后病例端粒酶阴性很可能与化疗有关。葡萄胎 虽属良性病变，但通常有15%左右恶变率[3，9]。本研究5/19(26.3%)端粒酶阳 性 (其中40%恶变)是否提示少量滋养细胞的永生化及预示以后的恶变，由于例数和随诊时间的 限制，尚无法得出肯定的结论，尽管有报道支持这一预测性[9]。相信随着研究 的深入和方法学的改进，端粒酶测定在滋养细胞疾病的诊断、疗效评定和预后方面将显示一 定价值。 参考文献
1，Morin GB.The human telomere terminal transferase enzyme is a ribonucleoprotein that synthesizes TTAGGG repeats[J].Cell ,1989;59(3)∶521
2，Kim NW,Piatyszek MA,Prowse KR et al.Specific association of human tel omerase activity with immortal cells and cancer[J].Science,1994;266(5193)∶201 1
3，宋鸿钊主编.滋养细胞肿瘤的诊断和治疗[M].第2版.北京：人民卫生出版社 ，1983∶1～12
4，张忠明，郑鹏生，岩坂 刚等.妇科肿瘤组织中端粒酶活性的检测[J].西安 医科大学学报，1999；20(1)∶17
5，Wright WE,Piatyszek MA,Rainey WE et al.Telomerase activity in huma n germline and embryonic tissues and cell[J].Dev Genet,1996;18(1)∶173
6，郑伟，石一夫，谢幸等.端粒酶RNA和端粒酶活性在人生殖道癌细胞株中的表 达[J].细胞生物学杂志，1998；20(1)∶25
7，Izutsu T,Kudo T, Nishiya et al.Telomerase activity in human chorio nic villi and placenta determined by TRAP and in situ TRAP assay[J].Placenta,1998 ;19(8)∶613
8，Takakura M,Kyo S, Kanaya T et al.Expression of human telomerase su buni ts and correlation with telomerase activity in cervical cancer[J].Cancer Res, 1998;58(4)∶1558
9，Bae SN, Kim SJ.Telomerase activity in complete hydatidiform mole[J]. Am J Obstet Gynecol,1999;180(2)∶328
(1999-07-23收稿 1999-08-10修回)
作者：张忠明 岩坂刚 司履生 郑鹏生 杉森甫 张蕴景
单位：(西安医科大学第一附属医院妇产科 西安 710061)
关键词：端粒酶；滋养细胞疾病；妊娠绒毛；肿瘤形成
西安医科大学学报000225摘要 目的 明确妊娠滋养细胞疾病和正常绒毛组织中的端粒酶表达状况，探索端粒酶活化在滋养细胞肿瘤形成中的作用。方法 应用以聚合酶链反应为基础的端粒酶测定方法(TRAP)，对不同临床类型妊娠滋养细胞疾病及不同发育阶段正常妊娠绒毛组织共61例的端粒酶活性进行检测。结果 绒毛膜癌及侵蚀性葡萄胎36.4%(4/11)端粒酶阳性，葡萄胎26.3%(5/19)阳性；早孕60d以内绒毛全部(10/10)阳性，此期以后的胎盘组织(21/21)阴性。结论 端粒酶在妊娠早期以后表达受到抑制，其活化在滋养细胞肿瘤形成中可能起重要作用；其测定对此类疾病的诊断、预后和疗效评定有潜在价值。
中图分类号 R737.33 文献标识码 A 文章编号 0258-0659(2000)02-0160-03
Telomerase expression in tissues of gestational trophoblastic diseases and normal chorionic villi
Zhang Zhongming Tsuyoshi Iwasaka Si Lüsheng
(Department of Obstetrics & Gynecology, First Affiliated Hospital, Xi′an Medical University, Xi′an 710061，China)
ABSTRACT Objective To investigate the prevalence of telomerase expression in gestational trophoblastic diseases and chorionic villi, and to evaluate the role of telomerase activation in tumorigenesis of tropholbastic tumors.Methods The telomeric repeat amplification protocol (TRAP) assay was used to detect telomerase activity in 61 samples from a variety of gestational tropholbastic tumors and different developing periods of normal chorionic villi.Results Telomerase activity was found in 36.4%(4/11) of gestational trophoblastic tumors (including choriocarcinomas and invasive moles),26.3%(5/19) of hydatidiform moles and 100%(10/10) of early embryonic villi, but was negative in the 21 cases of normal chorionic villi after 60 d of pregnancy .Conclusion Telomerase is expressed in the villi during very early embryonic period, but is repressed after the completion of organogenesis.Telomerase activation may play an important role in the tumorigenesis of trophoblastic tumors.Detection of telomerase activity has some potential value in differential diagnosis, prognosis and chemotherapeutic effect evaluation of these diseases.
KEY WORDS telomerase trophoblastic diseases chorionic villi tumorigenesis
端粒酶 (Telomerase) 是一种特殊的逆转录酶， 可以其RNA为模板合成端粒重复构件，使随细胞增殖而缩短的端粒长度不再短缩， 引起细胞的永生化[1，2]。 人类大部分体细胞没有可检测的端粒酶活性，恶性肿瘤细胞则相反[2]。 滋养细胞肿瘤是一类组织来源和生物行为明显不同于其他的特殊肿瘤[3]，本研究通过对妊娠滋养细胞疾病和正常妊娠绒毛组织中端粒酶活性的检测，探索端粒酶活化在此类肿瘤形成中的作用以及对其检测的临床价值。
1 材料和方法
1.1 病例及组织标本 病例选自1996 年10 月至1999 年3月在西安医科大学和佐贺医科大学附属医院被临床诊断的患者及终止妊娠孕妇共61例，年龄18～43岁(平均28岁)。其中绒毛膜癌5例、侵蚀性葡萄胎6例，孕6～23周葡萄胎19例；32d至43周妊娠31例。取清宫术或手术切除病变组织和人工流产或分娩后绒毛组织每例约10～200mg，迅速液氮冻存。1.2 方法 端粒酶活性测定根据Kim[2]报道的TRAP(Telomeric repeat amplification protocol)方法进行。主要步骤为：①组织端粒酶提取：前述冻存组织在4℃下经清洗、悬浮，CHAPS溶解液冷浴裂解，-80℃冻存。②端粒重复序列延伸，2μl端粒酶提取物加入43μl反应液中(含0.2μg TS引物[5′-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3′]、dNTPs及[α-32P]dCTP和[α-32P]dTTP,室温30min。③端粒酶失活处理。④PCR循环：反应体系中加入含0.1μg CX引物(5′-CCCTTACCCTTACCCTTACCCTAA-3′)和2U Taq DNA聚合酶的扩增液5μl。94℃变性处理3min后经94℃变性54s,50℃退火45s,72℃延伸60s共30个循环。⑤电泳及放射自显影。详细步骤见参考文献[4]。
1.3 统计学方法 组间比较用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 妊娠滋养细胞肿瘤组 11例临床Ⅰ～Ⅲa期恶性肿瘤滋养细胞肿瘤经0～12标准疗程化疗后因多种临床指征手术的病变组织中，4例(绒癌及侵蚀性葡萄胎各2例)端粒酶阳性。阳性病例为临床Ⅰ～Ⅱa期及化疗0～5个疗程者(占Ⅰ～Ⅱa期病例的4/9；0～5疗程化疗的4/6),Ⅱb、Ⅲa期(2例)及6个以上疗程(5例)者均为阴性。端粒酶阳性率在不同临床期别、疗程数间比较，无统计学差异。
附表 滋养细胞疾病和妊娠绒毛端粒酶检测结果及比较 组织类型
总例数
阳性例数
阳性率(比)
滋养细胞肿瘤
11
4
36.4%
绒毛膜癌
5
2
2/5
侵蚀性葡萄胎
6
2
2/6
葡萄胎
19
5
26.3%
妊娠绒毛
31
10
32.3%
<60d
10
10
100%
>60d
21
0
0
滋养细胞肿瘤、葡萄胎和妊娠绒毛各组间的比较P>0.05
60d以内绒毛与其他各组间的比较P<0.05
2.2 葡萄胎组 19例中5例端粒酶阳性。按病理学分级，滋养细胞轻、中、重度增生活跃端粒酶阳性比分别为2/10、2/6和1/3，差异无统计学意义。阳性病例中，2例随诊6和8周后恶变。
2.3 妊娠绒毛组 10例60d以内早孕绒毛端粒酶全部阳性，此期以后者阴性。
以上各组端粒酶活性检测结果及比较见附表。
3 讨 论
端粒酶在人类绝大多数正常体细胞中缺乏表达而在生殖干细胞中例外[5]。妊娠滋养细胞与胚胎组织细胞同源于生殖细胞，在早早孕阶段胚胎分化尚待开始，生物特性相似[3，5]。本研究中从早孕32d(种植仅数天)到60d以内绒毛组织端粒酶全部阳性而此期以后阴性，与文献报道结果基本一致[5～7]。说明从生殖细胞起端粒酶即以表达形式延续至早孕早期，其作用可能与其在生殖干细胞中的作用类似，与保证生物特性的精确遗传有关。由于早孕60d以内正是胚胎发育中从无定向性的幼稚干细胞到定向发育开始的时期，此期端粒酶的表达可能反映了细胞的增殖活跃而分化不足。随着定向分化的完成，端粒酶表达受到抑制而呈阴性。至于端粒酶表达的抑制是胚胎组织分化的原因还是结果尚需进一步探讨。
端粒酶活性是恶性肿瘤的普遍现象，其在肿瘤形成中的作用与其活化而引发的细胞永生化有关，因为端粒酶表达与细胞永生化是伴行的[2，4，6，8]，而永生化是细胞恶变的必经步骤。妊娠滋养细胞肿瘤是一类来源于妊娠滋养细胞而非源自体细胞的特殊肿瘤。滋养细胞本身既有许多与肿瘤细胞相似的生物学特性，即在妊娠早中期有侵蚀性，但以后得到抑制，滋养细胞肿瘤的形成正与这种抑制的不足或解除有关[3]。由于本研究中的肿瘤病例多经接近临床治愈的化疗，加之标本中血液成分对端粒酶抑制的可能，虽然仅有4例端粒酶阳性，阳性率明显低于文献报道的在其他肿瘤和滋养细胞肿瘤中85%～100%的检测结果[2，4，8，9]，但在治疗前病变中的端粒酶普遍表达的可能性极大。阳性病例中1例原诊断为绒癌I期第一疗程化疗未及完成即突发子宫穿孔行急症手术以及另3例化疗次数明显少于该组平均化疗次数的事实，对以上推论是个佐证。由端粒酶在妊娠早期绒毛中阳性，以后转阴，部分葡萄胎和滋养细胞肿瘤中再度阳性，且渐多表达的变化过程可以看出，端粒酶的活性与滋养细胞的幼稚性、增殖活跃和侵蚀性是相一致的，其活化在滋养细胞肿瘤形成中可能起重要作用。
虽然TRAP方法有很高的敏感度[2，4]，但由于取材的困难，目前在滋养肿瘤细胞 诊断 上还少有临床价值。本研究中大多数充分化疗后病例端粒酶阴性很可能与化疗有关。葡萄胎 虽属良性病变，但通常有15%左右恶变率[3，9]。本研究5/19(26.3%)端粒酶阳 性 (其中40%恶变)是否提示少量滋养细胞的永生化及预示以后的恶变，由于例数和随诊时间的 限制，尚无法得出肯定的结论，尽管有报道支持这一预测性[9]。相信随着研究 的深入和方法学的改进，端粒酶测定在滋养细胞疾病的诊断、疗效评定和预后方面将显示一 定价值。 参考文献
1，Morin GB.The human telomere terminal transferase enzyme is a ribonucleoprotein that synthesizes TTAGGG repeats[J].Cell ,1989;59(3)∶521
2，Kim NW,Piatyszek MA,Prowse KR et al.Specific association of human tel omerase activity with immortal cells and cancer[J].Science,1994;266(5193)∶201 1
3，宋鸿钊主编.滋养细胞肿瘤的诊断和治疗[M].第2版.北京：人民卫生出版社 ，1983∶1～12
4，张忠明，郑鹏生，岩坂 刚等.妇科肿瘤组织中端粒酶活性的检测[J].西安 医科大学学报，1999；20(1)∶17
5，Wright WE,Piatyszek MA,Rainey WE et al.Telomerase activity in huma n germline and embryonic tissues and cell[J].Dev Genet,1996;18(1)∶173
6，郑伟，石一夫，谢幸等.端粒酶RNA和端粒酶活性在人生殖道癌细胞株中的表 达[J].细胞生物学杂志，1998；20(1)∶25
7，Izutsu T,Kudo T, Nishiya et al.Telomerase activity in human chorio nic villi and placenta determined by TRAP and in situ TRAP assay[J].Placenta,1998 ;19(8)∶613
8，Takakura M,Kyo S, Kanaya T et al.Expression of human telomerase su buni ts and correlation with telomerase activity in cervical cancer[J].Cancer Res, 1998;58(4)∶1558
9，Bae SN, Kim SJ.Telomerase activity in complete hydatidiform mole[J]. Am J Obstet Gynecol,1999;180(2)∶328
(1999-07-23收稿 1999-08-10修回)
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