中华民族STR遗传结构及变化规律的研究(Ⅰ)
http://www.100md.com
李生斌. 郑海波. 冯继东. 于嘉琳.
STR.基因扫描.基因分型.基因资源.
参见附件(243kb)。
作者：李生斌 郑海波 冯继东 于嘉琳
单位：李生斌 郑海波(西安医科大学法医学院 西安 710061)；冯继东 于嘉琳(中国农业大学国家生物技术重点实验室 北京 100094)
关键词：STR；基因扫描；基因分型；基因资源
西安医科大学学报000101 摘要 选择9种STR基因位点和Amelogenin基因位点，以测 序为基础，研究我国汉族人群STR遗传结构。采用基因自动测序仪建立了10个位点基因分析 方法，通过对汉族群体的基因扫描、基因分型和遗传结构分析，获得了STR基因传递特征的 大量基因遗传数据，在汉族人群DP为1.05×10-10，EPP为0.9998，为建立我国不同 民族STR基因数据库、基因资源研究与保持奠定了基础，为生物考古、基因诊断、性别鉴定 、个人识别、司法审判、侦察破案提供有力的科学依据。
中图分类号 Q343.1 文献标识码 A
文章编号 0258-0659(2000)01-000 1-05
A study on the genetic structure and variational traitin of Chinese H an nation population
LI Shengbin, Zheng Haibo, Feng Jidong et al
(Forensic Institute of Xi′an Medical University,Xi′an 710061, China)
ABSTRACT Genetic distributions for 9 STR loci and amelogenin locus were determined in Han nation population based on DNA sequencing.The datas from the general Han n ation population were generated by using genescan,genotype and genetic distribution anaylsis.This study h ad a DP of 1.05×10-10 and a EPP of 0.9998.The results suggested that t he 9 STR loci and the amelogenin locus were useful DNA markers for the study of human orgin,gene diagnosis and archaeology, and also were usefull for the app lication to individ ual identification,sex identification,and providing the sufficient evidence for judgment in forensic sciences and even for the protect of the gene resources.
KEY WORDS STR genescan genotype gene resources
每一个个体在遗传上是不同的，而不同的体质不是在基因产物上，而是在DNA上的差异。这 些差异是由于不编码蛋白的区域和没有重要调节功能的区域发生了中立突变，这些中立突变 构成的DNA变异称为DNA多态性[1～3]。DNA多态性碱基顺序，对于一个个体来说保持 终生不变，并按孟德尔规律世代相传，对于一个群体而言，DNA多态性千差万别，换句话说 ，世界上没有两个DNA分型是完全相同的。从DNA多态性研究的发展可把它分为3个阶段。第 一阶段：Wyman和White首先报道人类染色体14号上限制片段长度的多态性，在0.5～20kb之 间。已知基因重组探针常用同位素标记。近年改良人工合成寡核苷酸探针，碱性磷酸酶标记 结合荧光素自显影术，技术基本上已国际标准化和被公认，并设有质量控制标准，应用前景 改观。第二阶段：Fowler等人发现在非编码区蕴藏着比较简单的DNA重复顺序( 15～70个碱基)称之为数目不定的串联重复(Variab le number of tandem repeats，VNTR)序列，其等位基因一般在500～1000bp，目前已经有5 000种以上DNA多态性被科学家确 认。第三阶段：Holly A等人在人类基因组中，发现二核苷、三核苷、四核苷重复的多态性 ，它由2～4个碱基组成特异序列，重复排列称之为短串联重复(Short tandem repeats，STR )[4～6]，在人类基因组中平均20kb就出现1个STR位点，其等位基因一般在100～3 50bp， 是目前理想的DNA遗传标记。本研究利用STR基因扫描(Genescan)分析技术体系，研究汉族人 群STR基因及遗传结构，为今后研究中华民族STR基因遗传结构和多基因疾病诊断研究奠定了 基础。
1 材料与方法
1.1 基因扫描原理
数目不定的短串联重复序列同时兼有序列多态 性，以荧光测序分析为基础，复合PCR 可有效 扩增多个STR位点，不同位点的等位基因同步分析，设有等位基因分子大小内标，电泳分离 后多色 测序和自动基因分型一次完成。基因扫描的位点是D3S1358、VWA、THO1、TPOX、CSF1PO、D5 S818、D13S317、D7S820、FGA和amelogenin基因。它们的国际基因库命名、定义、染色体 定位、重复序列、等位基因大小、已知基因分型见表1。
表1 Genescan位点的国际命名和特征 基因库位点
命 名
定 义
染色体定位
重复序列
等位基
因大小
已知等
位基因
Amelogenin
HUMAMEL
XP22.1～22.3
NA
107
NA
人Y染色体基因
and YP11.2
113
D3S1358
D3S1358
3P
TCTA
114～142
12,13,14,15,16,17,18,19
D5S818
D5S818
5q
AGAT
135～171
7,8,9,10,11,12,13,14,15,16
VWA
HUMVWFA31
12P12
TCTA
157～197
11,12,13,14,15,16,17,18,1 9,20,21
人范工因子基因
D13S317
D13S317
13q22～q31
GATA
206～234
8,9,10,11,12,13,14 ,15
THO1
HUMTHO1
11P15.5
AATG
169～189
5,6,7,8,9,9.3,10
人酪蛋白水解酶基因
TPOX
HUMTPOX
2P23～2pter
AATG
218～242
6,7,8,9,10,11,12,13
人甲状腺过氧化酶基因
FGA
HUMAFGA
4q
TTTC
219～267
18,19,20,21,22,23,24,25,26,26. 2,27,28,29,30
人纤维蛋白基因
D7S820
D7S820
7q
GATA
258～294
6,7,8,9,10,11,12,13,14,1 5
CSF1PO
HUMCSF1PO
5q33.3～34
AGAT
281～317
6,7,8,9,10,11,12,13 ,14,15
人c-fins原癌基因
1.2 材料
1.2.1标本采集 血液样本采自西安市长安县无关个体的 献血员，枸椽酸钾抗凝的静脉血1ml， 分别以0.3ml、0.3ml分装冷库-80℃贮存，0.3ml涂滤纸制成血痕室内装锡纸袋封口保存。
1.2.2 主要试剂 蛋白酶K购于Promega公司，金牌DNA聚 合酶购于PE公司，10对荧光标记引 物、三种等位基因标准品购于PE公司，化学试剂Rox-350、二甲苯酚、蔗糖、Tritonx-100 、Na EDTA购于Sigma公司。
1.2.3 主要实验仪器 自动测序仪(美国PE377A)，基因扩 增仪(美国PE9700)，电泳仪器(美 国Lifecode公司)，紫外分析仪(美国Lifecode公司)，8道可调移液器(Eppendorf公司)，微 量干热器(美国Lifecode公司)，36道样品收集软件，E377A分离软件，Genescan软件，Genot yper软件(美国ABI公司)。
1.3 方法
1.3.1 DNA提取 收集血样50μl(新鲜血液、冷冻陈旧血 液均 可)，采用盐析法提取DNA，再用无水乙醇沉淀纯化，干燥，加无核酸酶水100μl后备用。
1.3.2 DNA定性定量 依据Yield Gel定量法的结果。用无 核酸酶水稀释样本DNA浓度至1.0～1.5ng/μl。
1.3.3 复合基因扩增 反应总体积为5μl，其中含有样本 DNA 2μl，Master Mix 3μl，采 用PE9700时，最初变性为95℃ 5min，以确保金牌DNA聚合酶活性处于最佳状态，循环扩增条 件为94℃ 40s，59℃ 30s，72℃ 30s，最后延伸为60℃ 20min。
1.3.4 电泳 预电泳条件：时间20min，功率168W，电流4 8mA，电压3.0kV。
表2 STR等位基因频率 等位基因
汉族
(n＝174)
黑种人
(n＝195)
白种人
(n＝200)
等位基因
汉族
(n＝174)
黑种人
(n＝195)
白种人
(n＝200)
等位基因
汉族
(n＝174)
黑种人
(n＝195)
白种人
(n＝200)
D3S1358
THO1[ 9 D5S818
9
*
0.26
*
10
*
*
*
5
*
0.26
*
7
*
0.26
0.25
11
12
*
*
0.26
0.51
0.25
0.25
6
18.84
1 3.08
25.25
8
1.28
5.31
0.50
13
14
*
4.17
*
11.80
0.50
11.25
7
29.71
40 .00
15.00
9
8.97
2.05
2.25
14
15
4.17
35.71
11.8
27.95
11.25
28.25
8
5.07
22.82
9.25
10
11
11.54
41.03
7.44
25.39
6.75
39.2 5
15.2
16
*
26.19
0.26
32.31
*
2.25
9
43.48
13.08
13.75
12
25.64
32.56
33.25
17
18
20.83
10.71
21.80
4.62
22.25
14.50
9.3
2.97
10 .00
35.00
13
11.54
24.87
16.50
19
2.38
0.26
0.50
10
0.72
0.77
0.75
14
*
2.05
1.00
VWA
TPOX
15
*
0.26
*
12
*
*
*
6
*
8.21
*
16
*
*
0.25
13
*
0.54
*
7
0.60
3.59
*
D13S317
14
15
25.30
1.81
7.70
22.05
8.50
8.20
8
48.19
34.36
58.25
5
8
3.25
24.03
*
3.59
0.25
11.50
16
17
17.47
34.34
26.92
16.92
19.75
25.00
9
15.06
20 .00
11.25
9
13.64
2.31
7.75
18
19
15.66
5.42
13.85
8.46
11.00
10
0.60
9.23
4.7 5
10
12.99
2.31
6.75
20
21
*
*
2.06
*
1.50
0.25
11
32.53
21.54
22.5 0
11
23.38
27.18
31.25
22
*
0.26
*
12
3.01
3.08
3.00
12
20.13
44. 36
28.25
FGA
13
*
*
0.25
13
2.60
14.10
16.2
17
*
*
0.26
0.26
*
*
CSP1PO
14
15
*
*
6.15
*
4.25
0.25
18
19
0.65
4.55
0.51
4.62
1.50
6.25
6
*
0.26
*
D7S820
19.2
20
*
4.55
0.26
4.36
*
16.25
7
*
7.18
*
6
0.66
0.51
*
20.2
20
*
9.74
*
13.33
0.75
17.75
8
9
1.30
5.84
7.44
3.85
0.25
2.75
6.3
7
*
*
*
*
0.25
2.50
21.2
22
1.30
16.23
0.26
18.97
*
16.50
10
23.38
30.5 1
26.75
8
13.16
17.95
17.50
22.2
23
1.30
25.32
0.26
18.97
6.50
14.00
10.3
*
*
0.26
9
4.61
11.80
13.00
24
25
18.18
14.29
16.41
12.31
13.25
11.25
11
21.43
2 1.28
25.75
10
15.79
33.59
24.00
26
3.90
4.10
1.50
12
40.91
22.05
35.75
11
31.58
22.82
23.82
27
28
1.30
*
4.10
0.77
0.50
*
13
6.49
5.92
7.00
12
13
27.63
6.58
9.49
3.59
16.00
2.75
29
*
0.26
*
14
*
0.51
1.50
14
*
0.26
0.75
30
*
*
*
15
0.65
*
*
15
*
*
0.25
*表示基因频率为零
DNA样本处理：1μl DNA样本加入FLS/GS350 1.3μl混合，在95℃变 性2min，放置在冰浴中备用，等位基因标记物也一同处理。
电泳：在电泳胶板两边的上样槽内各加1μl等位基因标记物，中间的上样槽依次加入1μl样 本。电泳条件：时间90min、功率200W、电流60mA、电压3.0kV。ABI prism377在电泳开始时，激光检测仪就开始工作，收集电泳分离的全部电泳图谱信息， 自动贮存于电子计算机中。
1.3.5 Genescan分析数据 Genescan分析软件，把电泳收 集的电泳图谱信息经过电子计算机 处理成数据信息，这些数据信息与设计等位基因分子大小标记的内标比较被定义。电泳图谱 中不同位点的等位基因显示出不同颜色，同一位点的不同等位基因为同一种颜色，它们的迁 移率各不相同。电泳图谱中的颜色分为红、黄、蓝、绿。它们分别代表不同内容，红色为Ge nesean-350[Rox]，是设计的等位基因分子量大小标记物，在变性条件下产生的片段大小 ：50、75、100、139、150、160、200、250、300、340、350bp；黄色为NED，标记的基因位 点有D5S818，D13S317和D7S820；蓝色为S-FAM，标记的基因位点有D3S1358、VWA和FGA； 绿色为JOE，标记的基因位点有amelogenin、THO1、TPOX和CSF1PO。
1.3.6 Genotyper分析命名等位基因 采用的命名法是依 每个等位基因重复序列出现的次数用 阿拉伯数字表示。例如THO1位点5、6、7、8、9、9.3、10，分别表示重复序列出现的次数， 取为该等位基因的名称。
2 实验结果
2.1 STR位点和Amelogenin基因扫描图谱(图1见封4)和基因分型 (见图2a，2b)
图2a STR基因分型Amelogenin,THO1,TPOX,CSF1PO
图2b STR基因分型D5S818，D13S317，D7S820,D3S1358，VWA，FGA
2.2 黄种人、黑种人和白种人基因频率分布
表2为黄种人(汉族群体)及在美国的黑种人和高加索人基因频率数据。
2.3 3STR位点在群体中识别力和父权排除率比较
表3为黄种人(汉族群体)及在美国的黑种人和高加索人STR位点在群体中识别力和父权排除率 比较结果。
表3 STR位点群体识别力和父权排除率 位点
群体识别力
父权排除率
汉族
黑种人
白种人
汉族
黑种人
白种人
D3S1358
0.1110
0.102
0.078
0.4370
0.5250
0.5797
VWA
0.0854
0.058
0.065
0.6421
0.6394
0.6170
FGA
0.0598
0.035
0.036
0.6567
0.7202
0.7173
THO1
0.1553
0.102
0.094
0.5063
0.5250
0.5418
TPOX
0.1905
0.081
0.211
0.4796
0.5764
0.3589
CSF1PO
0.0870
0.070
0.122
0.6085
0.6048
0.4854
D5S818
0.1030
0.097
0.140
0.6602
0.5375
0.4554
D13S317
0.0813
0.031
0.074
0.7222
0.4725
0.5940
D7S820
0.0862
0.081
0.061
0.7366
0.5742
0.6307
Combined
1.05×10-10
1.23×10-10
2.79×10-10
0.9998
0.9996
0.9994
3 讨 论
采用基因自动测序仪，以测序为基础，建立了10个位点基因分析法，10个基因位点的 等位基 因在同一轨道的3种不同的颜色标记等位基因允许在大小范围内覆盖，而结果分析不受影响 。
这些微STR遗传标记等位基因命名的基础取决于电泳图谱上片段长度大小，对于卫星位点来 说，分箱处理尤为符合实际情况。例如THO1～5的片段长度为169bp，再做分箱法处理该位 点(169.00±0.50) bp都分成一箱，即表示同一个等位基础。分箱法鉴定等位基因时，相 差两个 bp就认为是不同的等位基因，例如THO1的9和9.3等位基因，THO1～9的片段大小为185bp，9. 3的片段大小为189bp。
PCR扩增效率取决于样本DNA质量，扩增常见的因素，DNA降解的程度，DNA的数量等因素。DN A定量的目的在于保证扩增所需的DNA模板的最小量，同时也减少了PCR抑制 剂的含量，并且有利于各种位点同步扩增达到最佳效果。10个位点扩增最终结果所需模板的 DNA量1.0～1.5ng，假若模板量大于2.5ng就会出现大量扩增产物，超出仪器检测和分析的能 力。更为严重的是，多个位点之间出现扩增产量不均或遗漏位点。
金牌DNA聚合酶需要高温才变得具有生物活性，这一特性和其他的酶存在着本质的不同，当 金牌DNA聚合酶96℃预热5min时，它的活性保持最大状态，这一特点使PCR反应可以在任何时 候开始，同一时间就可以准备更多的DNA样本，而且对提高PCR的产量和特异性发挥作用。
长度多态性揭示了限制性酶切和引物退火只能发生在重复顺序两侧翼，而不能在VNTR区和ST R区内部进行酶切或引物退火，这一点，有助于区别RFLP和扩增片段多态性。由于STR位点 在遗传上的多态性和稳定性，使既往RLFP和VNTR遗传标记所不能比拟的，通过对随机抽样17 4个体和5家系体的基因扫描、基因分型和遗传结构分析，获得了STR基因传递方式及遗传特 征 的大量科学数据。研究表明，汉族人群中有64种基因，149种基因型，STR位点在中国汉族群 体中识别率为1.05×10-10，父权排除率为0.9998，在黑种人识别率为2.79×10 -10，父权排除率为0.9994，在白种人识别率为1.23×10-10，父权排除率为0 .9 996，在法科学个体识别和亲权鉴定上，它可以取代既往的方法，将为司法审判、侦察破案 提供有力的科学依据。因此以测序为基础的STR基因扫描技术，为研究人类基因资源、连锁 分析、基因诊断、个体识别、生物考古开辟了一条途径，对于农牧业基因制图、培育良种具 有重要价值。
性别鉴定在医学、法医和体育运动等领域越来越重要，amelogenin结合9个S TR位点，即可以个体认定，又能确定性别，与传统的性别鉴定方法有本质不同。
我国民族众多，统称中华民族，但其内部各群体蛋白、基因组结构应该有很大差异，加之历 史悠久及灾荒战争等原因，人群迁移和混杂也比较普遍，更增加了基因遗传结构的复杂 性，用STR基因扫描技术，研究群体遗传结构，对基因研究、基因起源和进化具有重要意义 。
国家“95”攻关项目96-919-01-04-3
国家自然科学基金项目39670399，3997040
参 考 文 献
1.Joan Weisenbach,GyapayG,Dibc et al.A second-generation linkage map of the human genome〔J〕.Nature,1992；359:29
2.Davies JL,Kawaguchiy,Bennett ST et al.A genome-wide type 1 diabe tes susceptibility genes〔J〕.Nature,1992;359(6398):794
3.Dib C,Faure S,Fizames C et al.A comprehensive genetic map of the h uman g enome based on 5 264 microsatellites〔J〕.Nature,1996;14;380:(6570):152
4.Rosane Silva,Moura-Nato RS et al.Allelic frequency distribution fo r t hree VNTR markers D6S132,D7S467,D17S26-in Rio de Janeiro population,Brazil〔J〕. Forensic Science International,1998;94:33
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6.Marino MA,Devaney JM,Smith JK et al.Sequencing using capillary ele ctrophoresis of short tandem repeat alleles separated and purified by HPLC〔J〕.Electrophore sis,1998;19:108
作者：李生斌 郑海波 冯继东 于嘉琳
单位：李生斌 郑海波(西安医科大学法医学院 西安 710061)；冯继东 于嘉琳(中国农业大学国家生物技术重点实验室 北京 100094)
关键词：STR；基因扫描；基因分型；基因资源
西安医科大学学报000101 摘要 选择9种STR基因位点和Amelogenin基因位点，以测 序为基础，研究我国汉族人群STR遗传结构。采用基因自动测序仪建立了10个位点基因分析 方法，通过对汉族群体的基因扫描、基因分型和遗传结构分析，获得了STR基因传递特征的 大量基因遗传数据，在汉族人群DP为1.05×10-10，EPP为0.9998，为建立我国不同 民族STR基因数据库、基因资源研究与保持奠定了基础，为生物考古、基因诊断、性别鉴定 、个人识别、司法审判、侦察破案提供有力的科学依据。
中图分类号 Q343.1 文献标识码 A
文章编号 0258-0659(2000)01-000 1-05
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LI Shengbin, Zheng Haibo, Feng Jidong et al
(Forensic Institute of Xi′an Medical University,Xi′an 710061, China)
ABSTRACT Genetic distributions for 9 STR loci and amelogenin locus were determined in Han nation population based on DNA sequencing.The datas from the general Han n ation population were generated by using genescan,genotype and genetic distribution anaylsis.This study h ad a DP of 1.05×10-10 and a EPP of 0.9998.The results suggested that t he 9 STR loci and the amelogenin locus were useful DNA markers for the study of human orgin,gene diagnosis and archaeology, and also were usefull for the app lication to individ ual identification,sex identification,and providing the sufficient evidence for judgment in forensic sciences and even for the protect of the gene resources.
KEY WORDS STR genescan genotype gene resources
每一个个体在遗传上是不同的，而不同的体质不是在基因产物上，而是在DNA上的差异。这 些差异是由于不编码蛋白的区域和没有重要调节功能的区域发生了中立突变，这些中立突变 构成的DNA变异称为DNA多态性[1～3]。DNA多态性碱基顺序，对于一个个体来说保持 终生不变，并按孟德尔规律世代相传，对于一个群体而言，DNA多态性千差万别，换句话说 ，世界上没有两个DNA分型是完全相同的。从DNA多态性研究的发展可把它分为3个阶段。第 一阶段：Wyman和White首先报道人类染色体14号上限制片段长度的多态性，在0.5～20kb之 间。已知基因重组探针常用同位素标记。近年改良人工合成寡核苷酸探针，碱性磷酸酶标记 结合荧光素自显影术，技术基本上已国际标准化和被公认，并设有质量控制标准，应用前景 改观。第二阶段：Fowler等人发现在非编码区蕴藏着比较简单的DNA重复顺序( 15～70个碱基)称之为数目不定的串联重复(Variab le number of tandem repeats，VNTR)序列，其等位基因一般在500～1000bp，目前已经有5 000种以上DNA多态性被科学家确 认。第三阶段：Holly A等人在人类基因组中，发现二核苷、三核苷、四核苷重复的多态性 ，它由2～4个碱基组成特异序列，重复排列称之为短串联重复(Short tandem repeats，STR )[4～6]，在人类基因组中平均20kb就出现1个STR位点，其等位基因一般在100～3 50bp， 是目前理想的DNA遗传标记。本研究利用STR基因扫描(Genescan)分析技术体系，研究汉族人 群STR基因及遗传结构，为今后研究中华民族STR基因遗传结构和多基因疾病诊断研究奠定了 基础。
1 材料与方法
1.1 基因扫描原理
数目不定的短串联重复序列同时兼有序列多态 性，以荧光测序分析为基础，复合PCR 可有效 扩增多个STR位点，不同位点的等位基因同步分析，设有等位基因分子大小内标，电泳分离 后多色 测序和自动基因分型一次完成。基因扫描的位点是D3S1358、VWA、THO1、TPOX、CSF1PO、D5 S818、D13S317、D7S820、FGA和amelogenin基因。它们的国际基因库命名、定义、染色体 定位、重复序列、等位基因大小、已知基因分型见表1。
表1 Genescan位点的国际命名和特征 基因库位点
命 名
定 义
染色体定位
重复序列
等位基
因大小
已知等
位基因
Amelogenin
HUMAMEL
XP22.1～22.3
NA
107
NA
人Y染色体基因
and YP11.2
113
D3S1358
D3S1358
3P
TCTA
114～142
12,13,14,15,16,17,18,19
D5S818
D5S818
5q
AGAT
135～171
7,8,9,10,11,12,13,14,15,16
VWA
HUMVWFA31
12P12
TCTA
157～197
11,12,13,14,15,16,17,18,1 9,20,21
人范工因子基因
D13S317
D13S317
13q22～q31
GATA
206～234
8,9,10,11,12,13,14 ,15
THO1
HUMTHO1
11P15.5
AATG
169～189
5,6,7,8,9,9.3,10
人酪蛋白水解酶基因
TPOX
HUMTPOX
2P23～2pter
AATG
218～242
6,7,8,9,10,11,12,13
人甲状腺过氧化酶基因
FGA
HUMAFGA
4q
TTTC
219～267
18,19,20,21,22,23,24,25,26,26. 2,27,28,29,30
人纤维蛋白基因
D7S820
D7S820
7q
GATA
258～294
6,7,8,9,10,11,12,13,14,1 5
CSF1PO
HUMCSF1PO
5q33.3～34
AGAT
281～317
6,7,8,9,10,11,12,13 ,14,15
人c-fins原癌基因
1.2 材料
1.2.1标本采集 血液样本采自西安市长安县无关个体的 献血员，枸椽酸钾抗凝的静脉血1ml， 分别以0.3ml、0.3ml分装冷库-80℃贮存，0.3ml涂滤纸制成血痕室内装锡纸袋封口保存。
1.2.2 主要试剂 蛋白酶K购于Promega公司，金牌DNA聚 合酶购于PE公司，10对荧光标记引 物、三种等位基因标准品购于PE公司，化学试剂Rox-350、二甲苯酚、蔗糖、Tritonx-100 、Na EDTA购于Sigma公司。
1.2.3 主要实验仪器 自动测序仪(美国PE377A)，基因扩 增仪(美国PE9700)，电泳仪器(美 国Lifecode公司)，紫外分析仪(美国Lifecode公司)，8道可调移液器(Eppendorf公司)，微 量干热器(美国Lifecode公司)，36道样品收集软件，E377A分离软件，Genescan软件，Genot yper软件(美国ABI公司)。
1.3 方法
1.3.1 DNA提取 收集血样50μl(新鲜血液、冷冻陈旧血 液均 可)，采用盐析法提取DNA，再用无水乙醇沉淀纯化，干燥，加无核酸酶水100μl后备用。
1.3.2 DNA定性定量 依据Yield Gel定量法的结果。用无 核酸酶水稀释样本DNA浓度至1.0～1.5ng/μl。
1.3.3 复合基因扩增 反应总体积为5μl，其中含有样本 DNA 2μl，Master Mix 3μl，采 用PE9700时，最初变性为95℃ 5min，以确保金牌DNA聚合酶活性处于最佳状态，循环扩增条 件为94℃ 40s，59℃ 30s，72℃ 30s，最后延伸为60℃ 20min。
1.3.4 电泳 预电泳条件：时间20min，功率168W，电流4 8mA，电压3.0kV。
表2 STR等位基因频率 等位基因
汉族
(n＝174)
黑种人
(n＝195)
白种人
(n＝200)
等位基因
汉族
(n＝174)
黑种人
(n＝195)
白种人
(n＝200)
等位基因
汉族
(n＝174)
黑种人
(n＝195)
白种人
(n＝200)
D3S1358
THO1[ 9 D5S818
9
*
0.26
*
10
*
*
*
5
*
0.26
*
7
*
0.26
0.25
11
12
*
*
0.26
0.51
0.25
0.25
6
18.84
1 3.08
25.25
8
1.28
5.31
0.50
13
14
*
4.17
*
11.80
0.50
11.25
7
29.71
40 .00
15.00
9
8.97
2.05
2.25
14
15
4.17
35.71
11.8
27.95
11.25
28.25
8
5.07
22.82
9.25
10
11
11.54
41.03
7.44
25.39
6.75
39.2 5
15.2
16
*
26.19
0.26
32.31
*
2.25
9
43.48
13.08
13.75
12
25.64
32.56
33.25
17
18
20.83
10.71
21.80
4.62
22.25
14.50
9.3
2.97
10 .00
35.00
13
11.54
24.87
16.50
19
2.38
0.26
0.50
10
0.72
0.77
0.75
14
*
2.05
1.00
VWA
TPOX
15
*
0.26
*
12
*
*
*
6
*
8.21
*
16
*
*
0.25
13
*
0.54
*
7
0.60
3.59
*
D13S317
14
15
25.30
1.81
7.70
22.05
8.50
8.20
8
48.19
34.36
58.25
5
8
3.25
24.03
*
3.59
0.25
11.50
16
17
17.47
34.34
26.92
16.92
19.75
25.00
9
15.06
20 .00
11.25
9
13.64
2.31
7.75
18
19
15.66
5.42
13.85
8.46
11.00
10
0.60
9.23
4.7 5
10
12.99
2.31
6.75
20
21
*
*
2.06
*
1.50
0.25
11
32.53
21.54
22.5 0
11
23.38
27.18
31.25
22
*
0.26
*
12
3.01
3.08
3.00
12
20.13
44. 36
28.25
FGA
13
*
*
0.25
13
2.60
14.10
16.2
17
*
*
0.26
0.26
*
*
CSP1PO
14
15
*
*
6.15
*
4.25
0.25
18
19
0.65
4.55
0.51
4.62
1.50
6.25
6
*
0.26
*
D7S820
19.2
20
*
4.55
0.26
4.36
*
16.25
7
*
7.18
*
6
0.66
0.51
*
20.2
20
*
9.74
*
13.33
0.75
17.75
8
9
1.30
5.84
7.44
3.85
0.25
2.75
6.3
7
*
*
*
*
0.25
2.50
21.2
22
1.30
16.23
0.26
18.97
*
16.50
10
23.38
30.5 1
26.75
8
13.16
17.95
17.50
22.2
23
1.30
25.32
0.26
18.97
6.50
14.00
10.3
*
*
0.26
9
4.61
11.80
13.00
24
25
18.18
14.29
16.41
12.31
13.25
11.25
11
21.43
2 1.28
25.75
10
15.79
33.59
24.00
26
3.90
4.10
1.50
12
40.91
22.05
35.75
11
31.58
22.82
23.82
27
28
1.30
*
4.10
0.77
0.50
*
13
6.49
5.92
7.00
12
13
27.63
6.58
9.49
3.59
16.00
2.75
29
*
0.26
*
14
*
0.51
1.50
14
*
0.26
0.75
30
*
*
*
15
0.65
*
*
15
*
*
0.25
*表示基因频率为零
DNA样本处理：1μl DNA样本加入FLS/GS350 1.3μl混合，在95℃变 性2min，放置在冰浴中备用，等位基因标记物也一同处理。
电泳：在电泳胶板两边的上样槽内各加1μl等位基因标记物，中间的上样槽依次加入1μl样 本。电泳条件：时间90min、功率200W、电流60mA、电压3.0kV。ABI prism377在电泳开始时，激光检测仪就开始工作，收集电泳分离的全部电泳图谱信息， 自动贮存于电子计算机中。
1.3.5 Genescan分析数据 Genescan分析软件，把电泳收 集的电泳图谱信息经过电子计算机 处理成数据信息，这些数据信息与设计等位基因分子大小标记的内标比较被定义。电泳图谱 中不同位点的等位基因显示出不同颜色，同一位点的不同等位基因为同一种颜色，它们的迁 移率各不相同。电泳图谱中的颜色分为红、黄、蓝、绿。它们分别代表不同内容，红色为Ge nesean-350[Rox]，是设计的等位基因分子量大小标记物，在变性条件下产生的片段大小 ：50、75、100、139、150、160、200、250、300、340、350bp；黄色为NED，标记的基因位 点有D5S818，D13S317和D7S820；蓝色为S-FAM，标记的基因位点有D3S1358、VWA和FGA； 绿色为JOE，标记的基因位点有amelogenin、THO1、TPOX和CSF1PO。
1.3.6 Genotyper分析命名等位基因 采用的命名法是依 每个等位基因重复序列出现的次数用 阿拉伯数字表示。例如THO1位点5、6、7、8、9、9.3、10，分别表示重复序列出现的次数， 取为该等位基因的名称。
2 实验结果
2.1 STR位点和Amelogenin基因扫描图谱(图1见封4)和基因分型 (见图2a，2b)
图2a STR基因分型Amelogenin,THO1,TPOX,CSF1PO
图2b STR基因分型D5S818，D13S317，D7S820,D3S1358，VWA，FGA
2.2 黄种人、黑种人和白种人基因频率分布
表2为黄种人(汉族群体)及在美国的黑种人和高加索人基因频率数据。
2.3 3STR位点在群体中识别力和父权排除率比较
表3为黄种人(汉族群体)及在美国的黑种人和高加索人STR位点在群体中识别力和父权排除率 比较结果。
表3 STR位点群体识别力和父权排除率 位点
群体识别力
父权排除率
汉族
黑种人
白种人
汉族
黑种人
白种人
D3S1358
0.1110
0.102
0.078
0.4370
0.5250
0.5797
VWA
0.0854
0.058
0.065
0.6421
0.6394
0.6170
FGA
0.0598
0.035
0.036
0.6567
0.7202
0.7173
THO1
0.1553
0.102
0.094
0.5063
0.5250
0.5418
TPOX
0.1905
0.081
0.211
0.4796
0.5764
0.3589
CSF1PO
0.0870
0.070
0.122
0.6085
0.6048
0.4854
D5S818
0.1030
0.097
0.140
0.6602
0.5375
0.4554
D13S317
0.0813
0.031
0.074
0.7222
0.4725
0.5940
D7S820
0.0862
0.081
0.061
0.7366
0.5742
0.6307
Combined
1.05×10-10
1.23×10-10
2.79×10-10
0.9998
0.9996
0.9994
3 讨 论
采用基因自动测序仪，以测序为基础，建立了10个位点基因分析法，10个基因位点的 等位基 因在同一轨道的3种不同的颜色标记等位基因允许在大小范围内覆盖，而结果分析不受影响 。
这些微STR遗传标记等位基因命名的基础取决于电泳图谱上片段长度大小，对于卫星位点来 说，分箱处理尤为符合实际情况。例如THO1～5的片段长度为169bp，再做分箱法处理该位 点(169.00±0.50) bp都分成一箱，即表示同一个等位基础。分箱法鉴定等位基因时，相 差两个 bp就认为是不同的等位基因，例如THO1的9和9.3等位基因，THO1～9的片段大小为185bp，9. 3的片段大小为189bp。
PCR扩增效率取决于样本DNA质量，扩增常见的因素，DNA降解的程度，DNA的数量等因素。DN A定量的目的在于保证扩增所需的DNA模板的最小量，同时也减少了PCR抑制 剂的含量，并且有利于各种位点同步扩增达到最佳效果。10个位点扩增最终结果所需模板的 DNA量1.0～1.5ng，假若模板量大于2.5ng就会出现大量扩增产物，超出仪器检测和分析的能 力。更为严重的是，多个位点之间出现扩增产量不均或遗漏位点。
金牌DNA聚合酶需要高温才变得具有生物活性，这一特性和其他的酶存在着本质的不同，当 金牌DNA聚合酶96℃预热5min时，它的活性保持最大状态，这一特点使PCR反应可以在任何时 候开始，同一时间就可以准备更多的DNA样本，而且对提高PCR的产量和特异性发挥作用。
长度多态性揭示了限制性酶切和引物退火只能发生在重复顺序两侧翼，而不能在VNTR区和ST R区内部进行酶切或引物退火，这一点，有助于区别RFLP和扩增片段多态性。由于STR位点 在遗传上的多态性和稳定性，使既往RLFP和VNTR遗传标记所不能比拟的，通过对随机抽样17 4个体和5家系体的基因扫描、基因分型和遗传结构分析，获得了STR基因传递方式及遗传特 征 的大量科学数据。研究表明，汉族人群中有64种基因，149种基因型，STR位点在中国汉族群 体中识别率为1.05×10-10，父权排除率为0.9998，在黑种人识别率为2.79×10 -10，父权排除率为0.9994，在白种人识别率为1.23×10-10，父权排除率为0 .9 996，在法科学个体识别和亲权鉴定上，它可以取代既往的方法，将为司法审判、侦察破案 提供有力的科学依据。因此以测序为基础的STR基因扫描技术，为研究人类基因资源、连锁 分析、基因诊断、个体识别、生物考古开辟了一条途径，对于农牧业基因制图、培育良种具 有重要价值。
性别鉴定在医学、法医和体育运动等领域越来越重要，amelogenin结合9个S TR位点，即可以个体认定，又能确定性别，与传统的性别鉴定方法有本质不同。
我国民族众多，统称中华民族，但其内部各群体蛋白、基因组结构应该有很大差异，加之历 史悠久及灾荒战争等原因，人群迁移和混杂也比较普遍，更增加了基因遗传结构的复杂 性，用STR基因扫描技术，研究群体遗传结构，对基因研究、基因起源和进化具有重要意义 。
国家“95”攻关项目96-919-01-04-3
国家自然科学基金项目39670399，3997040
参 考 文 献
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