凋亡基因bcl-2/bax蛋白在胆囊良、恶性病变中表达及其临床意义
http://www.100md.com
郝秀原. 石景森. 周连锁. 王作仁.
胆囊癌.免疫组织化学.bcl-2基因家族.
参见附件(235kb)。
作者：郝秀原 石景森 周连锁 王作仁 卢云 田和平 韩梅荣
单位：郝秀原(山西省人民医院普外科 太原 030012)；石景森 周连锁 王作仁 卢云 田和平 韩梅荣(西安医科大学第一临床医学院肝胆外科研究室 西安 710061)
关键词：胆囊癌；免疫组织化学；bcl-2基因家族
西安医科大学学报000112摘要 选取胆囊炎标本16例，胆囊癌标本40例行免疫组织 化学(S-P法)，对凋亡相关基因bcl-2与bax染色。结果表明胆囊炎组、胆囊癌组及癌旁组 织bcl-2阳性率分别为43.7%、77.5%与81.8%，胆囊癌组高于胆囊炎组(P<0.05)，与 癌旁组织相比无显著性差异(P>0.05)。bax染色示胆囊炎组、胆囊癌组和癌旁组织阳性 率分别为81.5%、52.5%和54.5%，胆囊癌组与胆囊炎组相比差异显著(P<0.05)。癌旁 组织与胆囊炎组及胆囊癌组相比差异不显著。胆囊癌bcl-2阳性率与分化程度有关，Bax在 胆囊癌不同分化程度的表达率不同，bcl-2与bax相互表达具有一定联系(0.05
中图分类号 R735.8 文献标识码 A
文章编号 0258-0659(2000)01-003 1-03
Expression and clinical significance of bcl-2/bax protein in benign and malignant lesions of the gallbladder
Hao Xiuyuan, Shi Jingsen, Zhou Liansuo et al
(Hepato Bilary Surgery Research Lab,First Affiliated Hosp ital,Xian Medical University, Xi′an 710061,China)
ABSTRACT To explore the functioning of bcl-2 gene family in b iological behavior in benign and malignant lesions of the gallbladder,bcl-2 and Bax protein levels were assessed by immunohistochemical methods(S-P) in 16 spe c imens of cholecystitis and 40 of PCG.Statistical comparisons of immunostaining r e sults with clinical and pathological features were performed.The results showed that the percentages of detectable bcl-2 expression shown in PCG(77.5%) and ad ja cent dysplastic lesions were significantly higher than that in cholecystitis ( P <0.05).Enhanced bcl-2 expression in PCG wasnt correlated with histological s ubtypes, sex ,age, complicated gallstones and stage, but with grading.The percen t age of detectable bax expression shown in cholecystitis was significantly higher than that in PCG(0.025
KEY WORDS gallbladder neoplasms immunohistochemistry bcl-2 g ene family
近年分子生物学研究表明：胆囊癌为多基因遗传背景上环境致癌因素诱导下综合作用的结果 。bcl-2及p53在细胞凋亡中发挥重要的调控作用，特别是bcl-2/bax此两组凋亡促进/抑制 因素之间的比例，在许多肿瘤中作用已引起重视。本研究选取胆囊良、恶性病变标本，研 究bcl-2、bax的表达情况，结合临床资料分析，目的在于探讨凋亡相关因 素对于胆囊癌发病、侵袭等生物学行为的作用。进而揭示其临床意义及临床应用价值。
1 材料和方法
收集手术切除的胆囊炎标本16例，胆囊癌标本40例，均经HE染色证实。16例胆囊炎标 本中，伴胆石者13例，占81.3%。40例胆囊癌患者，年龄自33岁至77岁，平均年龄(57.8± 13.2)岁。其中男11例，女29例，男女之比为1∶2.6。其中合并结石者29例，占72.5% 。 均经10%福尔马林固定、石蜡包埋。5μm厚度切片，行免疫组化S-P法染色，DAB显然，苏 木素复染。鼠抗人bcl-2单抗购自Oncogene公司(工作浓度1∶80)，兔抗人bax多抗购自Sa nt a Cruez公司(工作浓度1∶100)。并用已知的bcl-2阳性的淋巴瘤做bcl-2阳性对照，b ax阳性扁桃体做bax阳性对照。TBS缓冲液替代一抗，SP试剂盒做阴性对照。胞浆呈棕黄色为 阳性，并以着色强弱依次划分为+(淡黄色)、(棕黄色)、(棕褐色)。切片由两人重复观 片，结果分歧时由第三人观片，讨论判定。应用SAS统计分析软件，对结果行χ2检验， χ2等级相关检验及确切概率法。
2 结 果
2.1 bcl-2检测 bcl-2阳性染色表现为棕黄色染色颗粒，位于 胞浆，在胆囊癌中偶有胞膜着色者，阳性细胞在腺体中呈均一着色，未分化癌呈弥漫分布( 图1)。胆囊炎组bcl-2阳性率为43.75%(7/16)，胆囊癌组阳性率为77.5%(31/40)。胆囊癌 组与胆囊炎组相比差异显著(χ2=5.97, 0.0250.05)，与癌组织相比差异无显著性(P>0.05)，但配对 资料示胆囊癌与癌旁组织二者bcl-2表达有联系(0.1>P>0.05)，但缺乏统计学显著联系。
图1 胆囊腺癌 bcl-2染色(+) SP×400
2.2 bax检测 bax阳性染色表现为棕黄色颗粒，均为胞 浆着色，在腺体中呈均一分布，胞浆内呈片状或斑块状(图2)。胆囊炎组bax的阳性率为81 . 25%(13/16)，胆囊癌组bax的阳性率为52.5(21/40)，癌旁组织阳性率为54.5%，胆囊癌组 与炎症组比较差异有显著性(χ2=3.96,0.0250.05)。
2.3 bcl-2、bax与胆囊癌关系 胆囊癌bcl-2、 bax共表达分析示均为阳性者14例，均为阴性者2例，bcl-2阳性同时bax阴性者17例，而bax 阳性时bcl-2阴性者7例，二者之间具有联系(χ2=2.97, 0.05
图2 胆囊腺癌 bax 染色(+) SP×400
表1 bcl-2.bax染色与临床、病理特征的关系 临床与病理
bcl -2
P
bax
P
-
+
-
+
性别
男
4
7
6
5
女
5
24
>0.05
13
16
>0.05
胆石
伴 发
5
24
14
15
未伴发
4
7
>0.05
5
6
>0.05
组织学类型
腺 癌
3
22
13
12
乳头状腺癌
4
5
1
8
粘液腺癌
1
2
2
1
未分化癌
1
2
3
0
Nevin分期
Ⅰ期
2
1
1
2
Ⅱ期
1
5
3
3
Ⅲ期
1
8
5
4
Ⅳ期
1
8
3
6
V期
4
9
7
6
分化程度
高分化
4
6
1
9
中分化
2
9
<0.05
4
7
低分化
2
14
11
5
未化化
1
2
3
0
3 讨 论
胆囊癌的发病率近年似有增高趋势，这与影像技术的进展有关，但早期确诊率低，手术治疗 效果不满意，又对放、化疗均不敏感，预后极差。病因不明，仅发现其与胆囊结石并 发率很高，也与胰胆管合流异常、职业、饮食、胆囊息肉样病变等有关。近年分子生物学在 肿瘤研究中的应用进一步揭示基因异常在包括胆囊癌发病中起至关重要的作用。
3.1 bcl-2表达与胆囊癌 bcl-2过表达与肿瘤的关系 已有报道。本项研究表明胆囊癌中有77.5%(31/40)存在bcl-2的阳性染色，与胆囊炎组比 较，差别有显著性(0.025
bcl-2在胆囊癌不同分期之间表达率不同，但是在不同的病理分期中表达率并无一定规律可 循 ，可见对于肿瘤的进展bcl-2似乎没有直接参与。此外bcl-2与性别、年龄与胆石病史等均 无统计学意义的联系。
3.2 bax与胆囊癌 bax是bcl-2家族中“抗凋亡”的典 型代表。用bcl-2特异性单克隆抗体免疫沉淀等方法，发现与bcl-2共沉淀的一种21KD蛋白 质，其与bcl-2基因序列具有20.8%的同源性，且具类似的高度保守的BH-1和BH-2同源结 构，以助bax自身或与bcl-2形成同源或异源二聚物，发挥生物功能。研究表明胆囊癌中bax 阳性率为52.5%(21/40)，与炎症组相比具有统计学差异。可见bax失活在胆囊癌发生中可能 具有作用。不同种族人群的乳腺癌中约1/3的患者可见bax表达降低，转移性乳腺癌研究表明 bax阳性率远低于正常乳腺上皮及原位癌。
bax表达与胆囊癌分化程度之间具有明显的联系。bax在胆囊癌不同分化程度之间差异明显， 由高分化(90%)、中分化(63.6%)、低分化(31.3%)到未分化(0%)，具有统计学意义(0.025
3.3 胆囊癌bcl-2/bax表达及临床意义 在40例胆囊癌 中，bcl-2与bax单一阳性分别为42.5%(17/40)与17.5%(7/40)，而bcl-2均为阳性的14例 ，占35%；均为阴性的2例，占5%，二者具有一定联系(χ2=2.98, 0.05
bcl-2/bax能否为肿瘤预后判断、治疗方式提供新途径尚需进一步研究。应用皮下注射bcl -2基因mRNA的18碱基反义寡聚核苷酸结合化疗，治疗非何杰金淋巴瘤，收到较好疗效。bcl -2/bax与胆囊癌生物学行为间关系尚需深入研究来阐明，并为临床诊治提供线索。
参考文献
1.石景森，刘刚，周连锁等.原发性胆囊癌601例临床分析[J]. 中华肝胆外科杂志，1998；4(4)∶216
2.郝秀原，石景森，王作仁等.胆囊癌BUS及CT诊断价值探讨[J].中华肝胆外科 杂志，1998；4(1)∶34
3.OhtaniT, Shirai Y,Tsukada K et al.Carcinoma of the gallbladder:CT evaluation of lymphatic spread[J].Radiology, 1993;189(3)∶875
4.黄晓明，高翼之.bcl-2及其相关蛋白与细胞死亡的调节[J].国外医学分子 生物学分册，1997；19(1)∶16
5.马英红，陈俊杰.Bax的基因结构与功能[J]。国外医学分子生物学分册，1997 ；19(5)∶212
6.Yamaguchi K,Enjoji M.Carcinoma of the gallbladder:A clinical pathology of 103 patients and a newly proposed staging[J].Cancer,1988;62(10)∶1425
7.黄洁夫.胆囊癌的流行病学特征[J].中国实用外科杂志，1997；17(9)∶517
8.Sheu L,Chen A, Meng C et al.Analysis of bcl-2 expression in norma l in flamed, dysplastic nasoparyngeal epithelia and phasopharynged carcinoma[J] .Human Pathol,1997;28(5)∶556
9.杨宝龙，顾方六，王行环等.凋亡相关基因bcl-2和bax蛋白在膀胱癌组之中的 表述及其临床意义[J].中华外科杂志，1997；35(10)∶602
10.Nakamura T,Nomura S,Sakai T et al.Expression of bcl-2 oncoprotei ns i n gastrointestinal and uterine carcinomals and their premalignant lesions[J].H uman Pathol ,1997;28(3)∶309
11.Krajewsky S, blomquist C, Franssila K et al.Reduced expression of pro apototic gene bax is associated with poor response rates to combination chemothe r apy and shorter survival in woman with metastatic breast adenocarcinoma[J].Can cer Res,1995;55(18)∶4471
12.Webb A, Wnningham P,Cotter F et al.bcl-2 antisense therapy in pa tients with non-Hodgkin lymphoma[J].Lancet,1997;349(11)∶1137
(1999-06-29收稿 1999-09-07修回)
作者：郝秀原 石景森 周连锁 王作仁 卢云 田和平 韩梅荣
单位：郝秀原(山西省人民医院普外科 太原 030012)；石景森 周连锁 王作仁 卢云 田和平 韩梅荣(西安医科大学第一临床医学院肝胆外科研究室 西安 710061)
关键词：胆囊癌；免疫组织化学；bcl-2基因家族
西安医科大学学报000112摘要 选取胆囊炎标本16例，胆囊癌标本40例行免疫组织 化学(S-P法)，对凋亡相关基因bcl-2与bax染色。结果表明胆囊炎组、胆囊癌组及癌旁组 织bcl-2阳性率分别为43.7%、77.5%与81.8%，胆囊癌组高于胆囊炎组(P<0.05)，与 癌旁组织相比无显著性差异(P>0.05)。bax染色示胆囊炎组、胆囊癌组和癌旁组织阳性 率分别为81.5%、52.5%和54.5%，胆囊癌组与胆囊炎组相比差异显著(P<0.05)。癌旁 组织与胆囊炎组及胆囊癌组相比差异不显著。胆囊癌bcl-2阳性率与分化程度有关，Bax在 胆囊癌不同分化程度的表达率不同，bcl-2与bax相互表达具有一定联系(0.05
中图分类号 R735.8 文献标识码 A
文章编号 0258-0659(2000)01-003 1-03
Expression and clinical significance of bcl-2/bax protein in benign and malignant lesions of the gallbladder
Hao Xiuyuan, Shi Jingsen, Zhou Liansuo et al
(Hepato Bilary Surgery Research Lab,First Affiliated Hosp ital,Xian Medical University, Xi′an 710061,China)
ABSTRACT To explore the functioning of bcl-2 gene family in b iological behavior in benign and malignant lesions of the gallbladder,bcl-2 and Bax protein levels were assessed by immunohistochemical methods(S-P) in 16 spe c imens of cholecystitis and 40 of PCG.Statistical comparisons of immunostaining r e sults with clinical and pathological features were performed.The results showed that the percentages of detectable bcl-2 expression shown in PCG(77.5%) and ad ja cent dysplastic lesions were significantly higher than that in cholecystitis ( P <0.05).Enhanced bcl-2 expression in PCG wasnt correlated with histological s ubtypes, sex ,age, complicated gallstones and stage, but with grading.The percen t age of detectable bax expression shown in cholecystitis was significantly higher than that in PCG(0.025
KEY WORDS gallbladder neoplasms immunohistochemistry bcl-2 g ene family
近年分子生物学研究表明：胆囊癌为多基因遗传背景上环境致癌因素诱导下综合作用的结果 。bcl-2及p53在细胞凋亡中发挥重要的调控作用，特别是bcl-2/bax此两组凋亡促进/抑制 因素之间的比例，在许多肿瘤中作用已引起重视。本研究选取胆囊良、恶性病变标本，研 究bcl-2、bax的表达情况，结合临床资料分析，目的在于探讨凋亡相关因 素对于胆囊癌发病、侵袭等生物学行为的作用。进而揭示其临床意义及临床应用价值。
1 材料和方法
收集手术切除的胆囊炎标本16例，胆囊癌标本40例，均经HE染色证实。16例胆囊炎标 本中，伴胆石者13例，占81.3%。40例胆囊癌患者，年龄自33岁至77岁，平均年龄(57.8± 13.2)岁。其中男11例，女29例，男女之比为1∶2.6。其中合并结石者29例，占72.5% 。 均经10%福尔马林固定、石蜡包埋。5μm厚度切片，行免疫组化S-P法染色，DAB显然，苏 木素复染。鼠抗人bcl-2单抗购自Oncogene公司(工作浓度1∶80)，兔抗人bax多抗购自Sa nt a Cruez公司(工作浓度1∶100)。并用已知的bcl-2阳性的淋巴瘤做bcl-2阳性对照，b ax阳性扁桃体做bax阳性对照。TBS缓冲液替代一抗，SP试剂盒做阴性对照。胞浆呈棕黄色为 阳性，并以着色强弱依次划分为+(淡黄色)、(棕黄色)、(棕褐色)。切片由两人重复观 片，结果分歧时由第三人观片，讨论判定。应用SAS统计分析软件，对结果行χ2检验， χ2等级相关检验及确切概率法。
2 结 果
2.1 bcl-2检测 bcl-2阳性染色表现为棕黄色染色颗粒，位于 胞浆，在胆囊癌中偶有胞膜着色者，阳性细胞在腺体中呈均一着色，未分化癌呈弥漫分布( 图1)。胆囊炎组bcl-2阳性率为43.75%(7/16)，胆囊癌组阳性率为77.5%(31/40)。胆囊癌 组与胆囊炎组相比差异显著(χ2=5.97, 0.025
图1 胆囊腺癌 bcl-2染色(+) SP×400
2.2 bax检测 bax阳性染色表现为棕黄色颗粒，均为胞 浆着色，在腺体中呈均一分布，胞浆内呈片状或斑块状(图2)。胆囊炎组bax的阳性率为81 . 25%(13/16)，胆囊癌组bax的阳性率为52.5(21/40)，癌旁组织阳性率为54.5%，胆囊癌组 与炎症组比较差异有显著性(χ2=3.96,0.025
2.3 bcl-2、bax与胆囊癌关系 胆囊癌bcl-2、 bax共表达分析示均为阳性者14例，均为阴性者2例，bcl-2阳性同时bax阴性者17例，而bax 阳性时bcl-2阴性者7例，二者之间具有联系(χ2=2.97, 0.05
图2 胆囊腺癌 bax 染色(+) SP×400
表1 bcl-2.bax染色与临床、病理特征的关系 临床与病理
bcl -2
P
bax
P
-
+
-
+
性别
男
4
7
6
5
女
5
24
>0.05
13
16
>0.05
胆石
伴 发
5
24
14
15
未伴发
4
7
>0.05
5
6
>0.05
组织学类型
腺 癌
3
22
13
12
乳头状腺癌
4
5
1
8
粘液腺癌
1
2
2
1
未分化癌
1
2
3
0
Nevin分期
Ⅰ期
2
1
1
2
Ⅱ期
1
5
3
3
Ⅲ期
1
8
5
4
Ⅳ期
1
8
3
6
V期
4
9
7
6
分化程度
高分化
4
6
1
9
中分化
2
9
<0.05
4
7
低分化
2
14
11
5
未化化
1
2
3
0
3 讨 论
胆囊癌的发病率近年似有增高趋势，这与影像技术的进展有关，但早期确诊率低，手术治疗 效果不满意，又对放、化疗均不敏感，预后极差。病因不明，仅发现其与胆囊结石并 发率很高，也与胰胆管合流异常、职业、饮食、胆囊息肉样病变等有关。近年分子生物学在 肿瘤研究中的应用进一步揭示基因异常在包括胆囊癌发病中起至关重要的作用。
3.1 bcl-2表达与胆囊癌 bcl-2过表达与肿瘤的关系 已有报道。本项研究表明胆囊癌中有77.5%(31/40)存在bcl-2的阳性染色，与胆囊炎组比 较，差别有显著性(0.025
bcl-2在胆囊癌不同分期之间表达率不同，但是在不同的病理分期中表达率并无一定规律可 循 ，可见对于肿瘤的进展bcl-2似乎没有直接参与。此外bcl-2与性别、年龄与胆石病史等均 无统计学意义的联系。
3.2 bax与胆囊癌 bax是bcl-2家族中“抗凋亡”的典 型代表。用bcl-2特异性单克隆抗体免疫沉淀等方法，发现与bcl-2共沉淀的一种21KD蛋白 质，其与bcl-2基因序列具有20.8%的同源性，且具类似的高度保守的BH-1和BH-2同源结 构，以助bax自身或与bcl-2形成同源或异源二聚物，发挥生物功能。研究表明胆囊癌中bax 阳性率为52.5%(21/40)，与炎症组相比具有统计学差异。可见bax失活在胆囊癌发生中可能 具有作用。不同种族人群的乳腺癌中约1/3的患者可见bax表达降低，转移性乳腺癌研究表明 bax阳性率远低于正常乳腺上皮及原位癌。
bax表达与胆囊癌分化程度之间具有明显的联系。bax在胆囊癌不同分化程度之间差异明显， 由高分化(90%)、中分化(63.6%)、低分化(31.3%)到未分化(0%)，具有统计学意义(0.025
3.3 胆囊癌bcl-2/bax表达及临床意义 在40例胆囊癌 中，bcl-2与bax单一阳性分别为42.5%(17/40)与17.5%(7/40)，而bcl-2均为阳性的14例 ，占35%；均为阴性的2例，占5%，二者具有一定联系(χ2=2.98, 0.05
bcl-2/bax能否为肿瘤预后判断、治疗方式提供新途径尚需进一步研究。应用皮下注射bcl -2基因mRNA的18碱基反义寡聚核苷酸结合化疗，治疗非何杰金淋巴瘤，收到较好疗效。bcl -2/bax与胆囊癌生物学行为间关系尚需深入研究来阐明，并为临床诊治提供线索。
参考文献
1.石景森，刘刚，周连锁等.原发性胆囊癌601例临床分析[J]. 中华肝胆外科杂志，1998；4(4)∶216
2.郝秀原，石景森，王作仁等.胆囊癌BUS及CT诊断价值探讨[J].中华肝胆外科 杂志，1998；4(1)∶34
3.OhtaniT, Shirai Y,Tsukada K et al.Carcinoma of the gallbladder:CT evaluation of lymphatic spread[J].Radiology, 1993;189(3)∶875
4.黄晓明，高翼之.bcl-2及其相关蛋白与细胞死亡的调节[J].国外医学分子 生物学分册，1997；19(1)∶16
5.马英红，陈俊杰.Bax的基因结构与功能[J]。国外医学分子生物学分册，1997 ；19(5)∶212
6.Yamaguchi K,Enjoji M.Carcinoma of the gallbladder:A clinical pathology of 103 patients and a newly proposed staging[J].Cancer,1988;62(10)∶1425
7.黄洁夫.胆囊癌的流行病学特征[J].中国实用外科杂志，1997；17(9)∶517
8.Sheu L,Chen A, Meng C et al.Analysis of bcl-2 expression in norma l in flamed, dysplastic nasoparyngeal epithelia and phasopharynged carcinoma[J] .Human Pathol,1997;28(5)∶556
9.杨宝龙，顾方六，王行环等.凋亡相关基因bcl-2和bax蛋白在膀胱癌组之中的 表述及其临床意义[J].中华外科杂志，1997；35(10)∶602
10.Nakamura T,Nomura S,Sakai T et al.Expression of bcl-2 oncoprotei ns i n gastrointestinal and uterine carcinomals and their premalignant lesions[J].H uman Pathol ,1997;28(3)∶309
11.Krajewsky S, blomquist C, Franssila K et al.Reduced expression of pro apototic gene bax is associated with poor response rates to combination chemothe r apy and shorter survival in woman with metastatic breast adenocarcinoma[J].Can cer Res,1995;55(18)∶4471
12.Webb A, Wnningham P,Cotter F et al.bcl-2 antisense therapy in pa tients with non-Hodgkin lymphoma[J].Lancet,1997;349(11)∶1137
(1999-06-29收稿 1999-09-07修回)
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