高效液相色谱法测定三七中三七皂苷R1及人参皂苷Rg1，Rb1的含量
摘要：目的：测定三七药材中三七皂苷的含量。方法：采用高效液相色谱法：C18色谱柱，乙腈∶水(15∶8512 min30∶7045 min15∶85 v/v)梯度洗脱，检测波长：203 nm。结果：三七R1在72.8～109 μg·ml1的范围内(r＝0.999 1)，人参Rg1在68.8～860 μg·ml1的范围内(r＝0.999 2)，Rb1在62.8～785 μg·ml1的范围内(r＝0.999 8)，线性关系良好。平均回收率大于98%，方法的变异系数小于3.0%。结论：方法简便，快速，准确，重现性好，可用于三七药材中三七皂苷的含量测定。
关键词：高效液相色谱法；三七皂苷R1；人参皂苷Rg1；人参皂苷Rb1
Determination of the Contents Ginsenoside Rg1 and Rb1 and Notoginsenoside R1 of Pananx notoginseng by HPLC
YANG Xuemei， LIU Xu， LIU Yanshan， XUN Dan， XU Jiangping
(Department of Chemistry, First Military Medical University， Guangzhou, 510515, China)
Abstract:Objective:A rapid high-performance liquid chromatographic method to determine the contents ginsenoside Rg1 and Rb1 and notoginsenoside R1 of Panax notoginseng was described.Methods:Agilent Hypersil C18 column was used,with mixture liquid of acetonitrile and water (15∶8512 min30∶7045 min15∶85 v/v) as mobile phase in a gradient mode. The wavelength of measurement was set at 203 nm.Results:The linear range of this method was 72.8～109 μg.ml1 for (R1) (r=0.999 1), 68.8～860 μg·ml1 for (Rg1)(r=0.999 2), 62.8～785 μg·ml1 for (Rb1)(r=0.999 8) respectively. The coefficient of variation was smaller than 3.0%(n=5).Conclusion:The method had the advantages of simplicity, rapidity, accuracy and precision, and can be used to identify and evaluate the quality of Panax notoginseng.
Key words:HPLC;Notoginsenoside R1;Ginsenoside Rg1;Ginsenoside Rb
三七 Panax Notoginseng (Burk.) F.H.Chen 为五加科人参属植物，是我国名贵的传统中药材，药用主要取其根，三七内含多种化学成分，其中三七总皂苷(PNS)是其主要有效成分，含量约占三七块根的10%～12%。现代药理研究证明三七总皂苷具有多方面的生物活性，主要表现在扩张冠状动脉、增加冠脉血流量、改善心肌代谢、抗自由基、抗凝、钙拮抗等方面[1,2]，其中主要成分三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1是三七最具代表性的特征化合物。为了实现中药标准的标准化，保证中药质量，本文采用HPLC测定了三七药材中的三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的含量。
1仪器与试药
Aglient Hypersil 1010型HPLC仪，DVD检测器；三七皂苷对照品：三七R1(批号0745200008)，人参Rg1(批号0703200117)，人参Rb1(批号704200115)均购自中国药品生物制品检定所；三七药材，由第二军医大学药学院生药教研室鉴定；乙腈、甲醇均为色谱纯。
2方法与结果
2.1色谱条件色谱柱 Agilent Hypersil(250 mm×4.0 mm,5 μm)C18柱；流动相为乙腈水(15∶8512 min30∶7045 min15∶85 v/v)；流速1 ml/min;柱温30℃；检测波长203 nm。
2.2对照品溶液及供试品的制备分别精密称取三七R1，人参Rg1及人参Rb1各约35 mg,置于5 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，制成混合对照品溶液备用；精密称取三七(40目)1 g，加入75%甲醇10 ml，浸泡约12 h，在60℃下，超声45 min，补足甲醇至刻度，离心，取上清液，过0.45 μm滤膜，为供试品溶液。
2.3标准曲线制备精密量取对照品溶液0.1，0.25，0.5，1.0，1.5 ml,分别置于10 ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，制成标准品溶液Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ，各取20 μl进样测定，色谱图见图1。以色谱峰峰面积为纵坐标，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1及Rb1对照品的浓度为横坐标进行线性回归，回归方程分别为：
三七R1在72.8～1 092 μg·ml1的范围内，Y＝4.88X+109.63(r=0.999 1,n=5)
人参Rg1在68.8～860 μg·ml1的范围内，Y＝6.45X+88.12(r=0.999 2,n=5)
人参Rb1在62.8～785 μg·ml1的范围内，Y＝5.14X+44.66(r=0.999 8,n=5)
2.4精密度实验精密吸取对照品溶液Ⅲ20 μl，重复进行5次，其RSD三七皂苷R1为0.96%，人参皂苷Rg1为0.78%，人参皂苷Rb1为0.84%。
2.5稳定性实验精密吸取标准溶液Ⅲ20 μl，分别于0,2,4,8,12,24 h进样测定，三七皂苷R1 RSD为1.35%(n=8)，人参皂苷Rg1的RSD为1.22%(n=8)，人参皂苷Rb1 RSD为1.57%(n=8),表明三七皂苷的溶液在24 h内稳定。
2.6方法的回收率精密称取三七粉(40目)1 g,准确加入三七R1，人参Rg1，人参Rb1标准液0.25 ml，按照供试品方法处理，进样测定，据标准曲线方程计算。求得回收率见表1。
图1三七对照品及药材的高效液相色谱图(略)
表1三七皂苷的回收率样(略)
2.7样品测定精密称取不同产地三七粉末1.0 g，按供试品方法处理，取20 μl进样测定，结果见表2。
表2不同产地三七药中三七皂苷的含量%(略)
3讨论
三七的主要活性部位总皂苷中除了含有本文测定的三七皂苷R1、人参皂苷Rg1,Rb1外，还含有人参皂苷Re等，以人参皂苷Rg1及Rb1所占比例较大，而三七皂苷R1则是中药三七中特有的皂苷成分，有文献报道测定三七皂苷R1、人参皂苷Rg1,Rb1,Re的HPLC[3,4]，但作者在实验中发现人参皂苷Re不稳定，测定过程中发生降解，所以本文只选择了三七中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1及Rb1这三个成分进行考察，对其含量进行了测定。不同产地三七的测定结果，发现广西的三七皂苷含量较高。本文所建立的HPLC法，重现性好，准确灵敏，可大大缩短分析时间，为三七药材质控提供了一定的依据和参考。
参考文献：
[1]苏雅，赵益贵，张宗鹏，等.三七三醇皂苷对动物血小板功能及血栓功能形成的影响[J]中草药，1996，27(11)：666666.
[2]ChanP, TomlinsonB. Antioxidant effects of Chinese traditional medicine:focus on trilinolein isolated from the Chinese herb sanchi (Panax pseudoginseng)[J].Clin Pharmacol 2000，40(5):457457.
[3]周迎春，赵怀清，梁宁，等.高效液相色谱法同时测定三七总皂苷中人参皂苷Rg1,Re,Rb1与三七皂苷R1含量[J].沈阳药科大学学报，2003，20(1)：2727.
[4]潘桂湘，高秀梅，张伯礼.HPLC测定复方丹参方中三七皂苷类成分的含量[J].中药新药与临床药理，2003，14(2)：112112.
(中国人民解放军第一军医大学，广东 广州510515), http://www.100md.com(杨雪梅 刘旭 刘艳山 荀旦 徐江平)
关键词：高效液相色谱法；三七皂苷R1；人参皂苷Rg1；人参皂苷Rb1
Determination of the Contents Ginsenoside Rg1 and Rb1 and Notoginsenoside R1 of Pananx notoginseng by HPLC
YANG Xuemei， LIU Xu， LIU Yanshan， XUN Dan， XU Jiangping
(Department of Chemistry, First Military Medical University， Guangzhou, 510515, China)
Abstract:Objective:A rapid high-performance liquid chromatographic method to determine the contents ginsenoside Rg1 and Rb1 and notoginsenoside R1 of Panax notoginseng was described.Methods:Agilent Hypersil C18 column was used,with mixture liquid of acetonitrile and water (15∶8512 min30∶7045 min15∶85 v/v) as mobile phase in a gradient mode. The wavelength of measurement was set at 203 nm.Results:The linear range of this method was 72.8～109 μg.ml1 for (R1) (r=0.999 1), 68.8～860 μg·ml1 for (Rg1)(r=0.999 2), 62.8～785 μg·ml1 for (Rb1)(r=0.999 8) respectively. The coefficient of variation was smaller than 3.0%(n=5).Conclusion:The method had the advantages of simplicity, rapidity, accuracy and precision, and can be used to identify and evaluate the quality of Panax notoginseng.
Key words:HPLC;Notoginsenoside R1;Ginsenoside Rg1;Ginsenoside Rb
三七 Panax Notoginseng (Burk.) F.H.Chen 为五加科人参属植物，是我国名贵的传统中药材，药用主要取其根，三七内含多种化学成分，其中三七总皂苷(PNS)是其主要有效成分，含量约占三七块根的10%～12%。现代药理研究证明三七总皂苷具有多方面的生物活性，主要表现在扩张冠状动脉、增加冠脉血流量、改善心肌代谢、抗自由基、抗凝、钙拮抗等方面[1,2]，其中主要成分三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1是三七最具代表性的特征化合物。为了实现中药标准的标准化，保证中药质量，本文采用HPLC测定了三七药材中的三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的含量。
1仪器与试药
Aglient Hypersil 1010型HPLC仪，DVD检测器；三七皂苷对照品：三七R1(批号0745200008)，人参Rg1(批号0703200117)，人参Rb1(批号704200115)均购自中国药品生物制品检定所；三七药材，由第二军医大学药学院生药教研室鉴定；乙腈、甲醇均为色谱纯。
2方法与结果
2.1色谱条件色谱柱 Agilent Hypersil(250 mm×4.0 mm,5 μm)C18柱；流动相为乙腈水(15∶8512 min30∶7045 min15∶85 v/v)；流速1 ml/min;柱温30℃；检测波长203 nm。
2.2对照品溶液及供试品的制备分别精密称取三七R1，人参Rg1及人参Rb1各约35 mg,置于5 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，制成混合对照品溶液备用；精密称取三七(40目)1 g，加入75%甲醇10 ml，浸泡约12 h，在60℃下，超声45 min，补足甲醇至刻度，离心，取上清液，过0.45 μm滤膜，为供试品溶液。
2.3标准曲线制备精密量取对照品溶液0.1，0.25，0.5，1.0，1.5 ml,分别置于10 ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，制成标准品溶液Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ，各取20 μl进样测定，色谱图见图1。以色谱峰峰面积为纵坐标，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1及Rb1对照品的浓度为横坐标进行线性回归，回归方程分别为：
三七R1在72.8～1 092 μg·ml1的范围内，Y＝4.88X+109.63(r=0.999 1,n=5)
人参Rg1在68.8～860 μg·ml1的范围内，Y＝6.45X+88.12(r=0.999 2,n=5)
人参Rb1在62.8～785 μg·ml1的范围内，Y＝5.14X+44.66(r=0.999 8,n=5)
2.4精密度实验精密吸取对照品溶液Ⅲ20 μl，重复进行5次，其RSD三七皂苷R1为0.96%，人参皂苷Rg1为0.78%，人参皂苷Rb1为0.84%。
2.5稳定性实验精密吸取标准溶液Ⅲ20 μl，分别于0,2,4,8,12,24 h进样测定，三七皂苷R1 RSD为1.35%(n=8)，人参皂苷Rg1的RSD为1.22%(n=8)，人参皂苷Rb1 RSD为1.57%(n=8),表明三七皂苷的溶液在24 h内稳定。
2.6方法的回收率精密称取三七粉(40目)1 g,准确加入三七R1，人参Rg1，人参Rb1标准液0.25 ml，按照供试品方法处理，进样测定，据标准曲线方程计算。求得回收率见表1。
图1三七对照品及药材的高效液相色谱图(略)
表1三七皂苷的回收率样(略)
2.7样品测定精密称取不同产地三七粉末1.0 g，按供试品方法处理，取20 μl进样测定，结果见表2。
表2不同产地三七药中三七皂苷的含量%(略)
3讨论
三七的主要活性部位总皂苷中除了含有本文测定的三七皂苷R1、人参皂苷Rg1,Rb1外，还含有人参皂苷Re等，以人参皂苷Rg1及Rb1所占比例较大，而三七皂苷R1则是中药三七中特有的皂苷成分，有文献报道测定三七皂苷R1、人参皂苷Rg1,Rb1,Re的HPLC[3,4]，但作者在实验中发现人参皂苷Re不稳定，测定过程中发生降解，所以本文只选择了三七中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1及Rb1这三个成分进行考察，对其含量进行了测定。不同产地三七的测定结果，发现广西的三七皂苷含量较高。本文所建立的HPLC法，重现性好，准确灵敏，可大大缩短分析时间，为三七药材质控提供了一定的依据和参考。
参考文献：
[1]苏雅，赵益贵，张宗鹏，等.三七三醇皂苷对动物血小板功能及血栓功能形成的影响[J]中草药，1996，27(11)：666666.
[2]ChanP, TomlinsonB. Antioxidant effects of Chinese traditional medicine:focus on trilinolein isolated from the Chinese herb sanchi (Panax pseudoginseng)[J].Clin Pharmacol 2000，40(5):457457.
[3]周迎春，赵怀清，梁宁，等.高效液相色谱法同时测定三七总皂苷中人参皂苷Rg1,Re,Rb1与三七皂苷R1含量[J].沈阳药科大学学报，2003，20(1)：2727.
[4]潘桂湘，高秀梅，张伯礼.HPLC测定复方丹参方中三七皂苷类成分的含量[J].中药新药与临床药理，2003，14(2)：112112.
(中国人民解放军第一军医大学，广东 广州510515), http://www.100md.com(杨雪梅 刘旭 刘艳山 荀旦 徐江平)