赤芍总苷对培养乳鼠心肌细胞损伤后细胞凋亡的影响
摘要：目的：通过建立心肌损伤模型探讨赤芍总苷对培养乳鼠心肌细胞损伤后细胞凋亡的影响。方法：以异丙基肾上腺素加入培养乳鼠心肌细胞造成缺血缺氧损伤模型，对比分析正常组、不同剂量赤芍总苷组和辅酶Q10阳性对照组的细胞形态学以及心肌细胞凋亡等角度探讨赤芍总苷对损伤心肌细胞保护作用的机理及其有效剂量，为中药有效成分治疗心血管疾病提供实验及理论依据。结果：损伤组细胞搏动加速，存活率下降，显示出明显的DNA凋亡特征；而辅酶Q10组和赤芍总苷组上述指标都有不同程度的改善，其中高剂量赤芍总苷组的保护作用优于阳性对照组。结论：赤芍总苷对异丙基肾上腺素造成的心肌损伤具有保护作用，并且呈现剂量依赖关系，作用机理与改善心肌缺血缺氧状态，维持细胞正常的能量代谢和收缩功能，抑制细胞凋亡有关。
关键词：赤芍总苷；心肌细胞培养；细胞形态学；细胞凋亡
The Influence of Total Paeony Glycoside on the Apoptosis of Cultured Neonatal Rat Myocardial Cell Injury
HUANG Haixia1, MO Xiaoyan1， DU Xiaoyang2, ZHANG Zhenqiang2, GENG Tao2
(1.School of Life Science and Technology,Xi'an Jiaotong University,Xi'an 710049, China; 2.Medical School, Xi'an Jiaotong University, Xi'an 710061, China)
Abstract:Objective: To investigate the influence of total paeony glycoside (TPG) on the apoptosis of cultured neonatal rat cardiomyocytes injured by developing the injured model.Methods:The ischemia and hypoxia injured model of cultured neonatal rat cardiomyocytes was induced by isoprenaline (ISO). The cell morphology and apoptosis in normal control group, different dosage TPG groups and coenzyme Q10 (CoQ10) positive control group were respectively analyzed and compared. The protective mechanism and effective doses of TPG on the injured myocardial cell were investigated from the angles of biochemistry and molecular biology. The study provides both experimental and theoretical bases for the treatment of cardiovascular disease by the effective compositions of TCM.Results:Compared with normal control group, injured myocardial cells wrinkled and the frequency of beating accelerated and the survival rate of myocardial cells decreased obviously, and the DNA in injured group had obvious apoptotic phenomenon；but in TPG and CoQ10 groups all of detective indexes had improvement in varying degrees, especially high-dose TPG group in that the protective effect was better than or closed to positive control group.Conclusion:TPG has notable protective action to injured cardiomyocytes caused by ISO, which shows the relationship to dose-dependence. The functional mechanism of TPG relates to the improvement of myocardial ischemia and hypoxia,can improve the survival rate of myocardial cells, maintain normal energy metabolism and systolic function, restrain the appearance of apoptosis.
Key words:Total paeony glycoside;Cultured myocardial cell;Cell morphology;Apoptosis
近年的研究表明，一些中草药及其有效成分对缺血缺氧性心肌细胞损伤具有抗氧化保护作用[1，2]，活血化瘀、益气养阴、补血通络这类中药的作用机理与细胞凋亡之间存在着某些规律性或必然性联系，对细胞凋亡发生有一定的抑制作用[3～5]。中药总成分的药理作用强、毒性小，临床应用效果好于单体，是中药研究的一个方向[6]。目前中药对心血管疾病的研究大多是单味中药和复方中药，而对于中药有效成分研究的文献报道很少。赤芍是毛莨科植物芍药(Paeonia lactiflora Pall)的干燥根，其主要活性成分为芍药苷、芍药内酯苷、羟基芍药苷、苯甲酰芍药苷等单萜苷类化合物，总称为赤芍总苷(total paeony glycoside，TPG)。以往的研究显示TPG具有抗动脉粥样硬化、保护心脏和肝脏、抗肿瘤等作用[7]，但从生物化学及分子生物学角度研究TPG的报道甚少。本文通过建立体外培养乳鼠心肌细胞损伤模型，观察并检测实验各组细胞的形态学变化、细胞死亡率以及心肌细胞凋亡等指标，进一步探讨TPG保护心肌细胞损伤的作用机理，为赤芍总苷防治心血管疾病提供理论和实验依据。
1材料与方法
1.1仪器与试剂
1.1.1主要仪器 HERAEUS二氧化碳培养箱(德国)，OLYMPUS倒置显微镜(日本)，UV-2100紫外分光光度计(美国)和J2-MC高速冷冻离心机(美国)。
1.1.2试剂与药品DMEM培养基和胰蛋白酶(美国GIBCO)，小牛血清(杭州四季青)，赤芍总苷(自制)，异丙基肾上腺素(Isoprenaline ISO，上海禾丰制药有限公司)，辅酶Q10(Coenzyme Q10 CoQ10，安徽省马鞍山生物化学制药厂)，GOT、LDH、CK检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)。
1.2实验方法
1.2.1心肌细胞原代培养出生1～3 d的SD乳鼠(本校动物实验中心)，无菌条件下用直剪剖开胸腔取心尖部，置于盛有DMEM培养基的培养皿中，将心肌组织剪成1 mm×1 mm×1 mm大小。加入0.06%胰酶消化液，于37℃水浴中磁力搅拌进行多次消化，收集心肌细胞。用含有20%小牛血清的DMEM培养基制成细胞悬液，调节细胞密度为105～106 个·ml-1之间，将细胞接种于培养瓶中，于5%CO2培养箱中37℃培养。在倒置显微镜下观察细胞的生长状态和搏动情况。60 h后更换培养基并加药，继续培养24 h后收集培养液，用0.25%胰酶消化心肌细胞后收集，置冰箱冷冻保存待用。
1.2.2实验分组将培养60 h的心肌细胞按照每组7瓶分别处理，分为：(1)正常对照组；(2)药物损伤组：加入ISO使其终浓度为10-4 g/ml；(3)TPG保护组：加入ISO 30 min后加入TPG，浓度分别为0.625 μg/ml (低剂量组)、1.25 μg/ml(中剂量组)、2.50 μg/ml(高剂量组)；(4)阳性对照组：加入ISO 30 min后加入CoQ10使其终浓度为10-4 g/ml。
1.3统计学处理将所有数据都输入计算机，用SPSS for windows11.5版本软件进行单因素方差分析，计算结果以均数±标准差(±s)表示，检验水准α＝0.05。
Vs正常组**P<0.01，极显著性差异；Vs正常组*P<0.05，显著性差异。Vs损伤组##P<0.01，极显著性差异；Vs损伤组#P<0.05，显著性差异。
2心肌细胞鉴定结果
加药后，24 h内不同时间段于倒置显微镜下观察细胞，从细胞形态及搏动频率观察药物对细胞的作用。收集各组细胞并进行细胞计数和台盼蓝染色鉴定细胞存活率，根据细胞密度(×104个/ml)和细胞存活率分析赤芍总苷对心肌细胞的作用。
2.1心肌细胞形态变化
2.1.1正常组正常培养心肌细胞(图1)呈梭形或不规则三角形，核呈卵圆形并居中，搏动规律且有力，细胞搏动频率不一，频率为60～120次/min。
2.1.2损伤组损伤心肌细胞(图2～3)皱缩变圆，伪足减少，细胞搏动频率加快至100～200次/min，细胞搏动频率不一。
2.1.3TPG组TPG组心肌细胞(图4～6)的生长状态较好，细胞形态明显好于损伤组，且贴壁细胞多于损伤组；高剂量加药组的细胞生长状态及细胞存活率要好于低剂量的加药组，细胞的搏动频率明显慢于损伤组，搏动有力。随着赤芍总苷浓度的增大，细胞生长状态愈好，搏动频率愈慢，细胞搏动频率依次为120～180，110～160，80～120次/min。
2.1.4阳性对照组辅酶Q10组(图7)的贴壁细胞及生长状态好于损伤组，细胞的搏动频率较损伤组慢，细胞搏动频率不一，频率为80～130次/min。
图1正常对照组培养心肌细胞形态(略)
图2损伤组培养心肌细胞形态(略)
图3损伤组培养心肌细胞形态(略)
图4低剂量TPG组培养心肌细胞形态(略)
图5中剂量TPG组培养(略)
图6(略)
图7辅酶Q10阳性对照组培养心肌细胞形态(略)
2.2心肌细胞密度及存活率变化见表1。
表1心肌细胞密度及存活率变化(略)
由表1可见，正常对照组的细胞密度比较大，细胞存活率较高，达到95%±3%；异丙基肾上腺素导致的细胞损伤组，其细胞密度显著减少，细胞存活率仅有68%±5%；阳性对照组的细胞密度和细胞存活率较损伤组明显增大；赤芍总苷组细胞密度和存活率有显著增大的趋势，且随着赤芍总苷浓度的增大，细胞数量愈多，中、高剂量的赤芍总苷组细胞密度要大于阳性对照组。
2.3心肌细胞凋亡根据培养细胞DNA提取法[8]提取各组心肌细胞DNA，以λDNA(48 502 bp)为分子量标准，将各组DNA点样于1.0%琼脂糖凝胶，于75mA条件下电泳40 min。结果见图8～9。
图8心肌细胞DNA电泳图9心肌细胞DNA电泳(略)
图9(略)
3讨论
培养心肌细胞已成为一种广泛应用的实验技术，在心脏学研究领域中，可以建立许多心肌模型进行研究，实验证明这是从细胞和分子水平反映实验效果的一个很好的模型[9]。本实验用ISO造成培养乳鼠心肌细胞的缺血缺氧损伤模型，以CoQ10作为保护心肌细胞的阳性对照药物，旨在对比观察不同剂量TPG的保护作用。ISO可加快心率，使心肌耗氧量明显增加，造成心肌处于相对缺血缺氧状态[10]；而CoQ10具有稳定生物膜、抗氧化、清除自由基以及保护心肌的作用[11]。实验结果证实，ISO对培养60 h的乳鼠心肌细胞有明显的损伤作用；加入CoQ10的培养细胞形态学变化明显好于损伤组，培养液中心肌酶谱及抗氧化指标水平均比损伤组有显著降低，且DNA无凋亡现象，说明CoQ10对损伤的心肌细胞具有较好的保护作用。以上结果进一步证实培养乳鼠心肌细胞损伤缺血缺氧模型是一种较理想的离体研究心肌损伤的模型，可靠性、重复性较好，易于进行给药观察。
本实验采用生化实验法检测心肌细胞凋亡的状况。琼脂糖凝胶电泳结果显示，损伤组DNA降解为分子量较小的片段，呈现细胞凋亡所特有的“梯状带”；各TPG组和辅酶Q10阳性对照组呈现出类似正常对照组的单一条带，无凋亡现象。实验结果表明，ISO对心肌细胞凋亡有诱导作用，致使DNA链断裂；TPG可抑制细胞凋亡的出现。正常心肌细胞DNA的迁移距离与λDNA相接近，提示乳鼠心肌细胞DNA的分子大约为48 000 bp。
综上所述，TPG对ISO造成的培养乳鼠心肌细胞损伤具有保护作用，而且TPG的保护作用呈现剂量依赖关系，检测指标的改善与TPG的加药量有关，保护作用随着剂量增大而明显增强，高剂量TPG组的保护作用优于辅酶Q10组。作用机理与TPG改善心肌细胞的能量和物质代谢，从而提高心肌细胞的存活，保证心肌细胞的正常收缩功能，减轻细胞膜损伤程度，较好地控制了DNA链的断裂，降低细胞凋亡的出现有关。
参考文献：
[1]黄海霞，莫晓燕.中药对心肌细胞损伤的保护作用[J].中草药,2003，34(12)：11501152.
[2]单家银，屈松柏.中药对培养心肌细胞损伤保护作用的研究进展[J].湖北中医学院学报，2000，2(1)：5253.
[3]李源,段红,王天成,等.川芎嗪对再灌注大鼠心肌细胞c-fos基因表达及凋亡的影响[J].心脏杂志,2000,12(3):213215.
[4]赵明中,刘岚,汪家瑞,等.通心络胶囊对异丙肾上腺素致大鼠心肌损伤保护作用的实验研究[J].中国中西医结合杂志,2001,21(1):5153.
[5]王玉林,彭京洪,马沛然,等.中药芪芍五味合剂对病毒性心肌炎小鼠心肌细胞凋亡和坏死的影响[J].山东医药,2002, 42(22):1619.
[6]刘干中，王建华，周金黄.世纪之交:现代中医药药理学的回顾与展望[J].基础医学与临床,2000,2(5):385387.
[7]阮金兰,赵钟祥,曾庆忠，等.赤芍化学成分和药理作用的研究进展[J].中国药理学通报,2003,19(9): 965970.
[8]鄂征.组织培养和分子细胞学技术[M].北京：北京出版社,1995.271273.
[9]董丰,龚开政,张振刚.原代心肌细胞培养方法的探讨[J].大连医科大学学报, 2001,23(4):307308.
[10]徐晋,张杰武,马肃,等.异丙基肾上腺素导致大鼠心肌损伤的酶组织化学及超微结构观察[J].中国组织化学与细胞化学杂志,1995,4(3):301303.
[11] Mellors A, Tappel AL. The inhibition of mitochondrial peroxidation by ubiquinone and ubiquinol[J].J Biol Chem,1966,241:43534356.
(1.西安交通大学生命科学与技术学院，陕西 西安710049；2.西安交通大学医学院，陕西 西安710061), 百拇医药(黄海霞 莫晓燕 杜晓阳 张振强 耿涛)
关键词：赤芍总苷；心肌细胞培养；细胞形态学；细胞凋亡
The Influence of Total Paeony Glycoside on the Apoptosis of Cultured Neonatal Rat Myocardial Cell Injury
HUANG Haixia1, MO Xiaoyan1， DU Xiaoyang2, ZHANG Zhenqiang2, GENG Tao2
(1.School of Life Science and Technology,Xi'an Jiaotong University,Xi'an 710049, China; 2.Medical School, Xi'an Jiaotong University, Xi'an 710061, China)
Abstract:Objective: To investigate the influence of total paeony glycoside (TPG) on the apoptosis of cultured neonatal rat cardiomyocytes injured by developing the injured model.Methods:The ischemia and hypoxia injured model of cultured neonatal rat cardiomyocytes was induced by isoprenaline (ISO). The cell morphology and apoptosis in normal control group, different dosage TPG groups and coenzyme Q10 (CoQ10) positive control group were respectively analyzed and compared. The protective mechanism and effective doses of TPG on the injured myocardial cell were investigated from the angles of biochemistry and molecular biology. The study provides both experimental and theoretical bases for the treatment of cardiovascular disease by the effective compositions of TCM.Results:Compared with normal control group, injured myocardial cells wrinkled and the frequency of beating accelerated and the survival rate of myocardial cells decreased obviously, and the DNA in injured group had obvious apoptotic phenomenon；but in TPG and CoQ10 groups all of detective indexes had improvement in varying degrees, especially high-dose TPG group in that the protective effect was better than or closed to positive control group.Conclusion:TPG has notable protective action to injured cardiomyocytes caused by ISO, which shows the relationship to dose-dependence. The functional mechanism of TPG relates to the improvement of myocardial ischemia and hypoxia,can improve the survival rate of myocardial cells, maintain normal energy metabolism and systolic function, restrain the appearance of apoptosis.
Key words:Total paeony glycoside;Cultured myocardial cell;Cell morphology;Apoptosis
近年的研究表明，一些中草药及其有效成分对缺血缺氧性心肌细胞损伤具有抗氧化保护作用[1，2]，活血化瘀、益气养阴、补血通络这类中药的作用机理与细胞凋亡之间存在着某些规律性或必然性联系，对细胞凋亡发生有一定的抑制作用[3～5]。中药总成分的药理作用强、毒性小，临床应用效果好于单体，是中药研究的一个方向[6]。目前中药对心血管疾病的研究大多是单味中药和复方中药，而对于中药有效成分研究的文献报道很少。赤芍是毛莨科植物芍药(Paeonia lactiflora Pall)的干燥根，其主要活性成分为芍药苷、芍药内酯苷、羟基芍药苷、苯甲酰芍药苷等单萜苷类化合物，总称为赤芍总苷(total paeony glycoside，TPG)。以往的研究显示TPG具有抗动脉粥样硬化、保护心脏和肝脏、抗肿瘤等作用[7]，但从生物化学及分子生物学角度研究TPG的报道甚少。本文通过建立体外培养乳鼠心肌细胞损伤模型，观察并检测实验各组细胞的形态学变化、细胞死亡率以及心肌细胞凋亡等指标，进一步探讨TPG保护心肌细胞损伤的作用机理，为赤芍总苷防治心血管疾病提供理论和实验依据。
1材料与方法
1.1仪器与试剂
1.1.1主要仪器 HERAEUS二氧化碳培养箱(德国)，OLYMPUS倒置显微镜(日本)，UV-2100紫外分光光度计(美国)和J2-MC高速冷冻离心机(美国)。
1.1.2试剂与药品DMEM培养基和胰蛋白酶(美国GIBCO)，小牛血清(杭州四季青)，赤芍总苷(自制)，异丙基肾上腺素(Isoprenaline ISO，上海禾丰制药有限公司)，辅酶Q10(Coenzyme Q10 CoQ10，安徽省马鞍山生物化学制药厂)，GOT、LDH、CK检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)。
1.2实验方法
1.2.1心肌细胞原代培养出生1～3 d的SD乳鼠(本校动物实验中心)，无菌条件下用直剪剖开胸腔取心尖部，置于盛有DMEM培养基的培养皿中，将心肌组织剪成1 mm×1 mm×1 mm大小。加入0.06%胰酶消化液，于37℃水浴中磁力搅拌进行多次消化，收集心肌细胞。用含有20%小牛血清的DMEM培养基制成细胞悬液，调节细胞密度为105～106 个·ml-1之间，将细胞接种于培养瓶中，于5%CO2培养箱中37℃培养。在倒置显微镜下观察细胞的生长状态和搏动情况。60 h后更换培养基并加药，继续培养24 h后收集培养液，用0.25%胰酶消化心肌细胞后收集，置冰箱冷冻保存待用。
1.2.2实验分组将培养60 h的心肌细胞按照每组7瓶分别处理，分为：(1)正常对照组；(2)药物损伤组：加入ISO使其终浓度为10-4 g/ml；(3)TPG保护组：加入ISO 30 min后加入TPG，浓度分别为0.625 μg/ml (低剂量组)、1.25 μg/ml(中剂量组)、2.50 μg/ml(高剂量组)；(4)阳性对照组：加入ISO 30 min后加入CoQ10使其终浓度为10-4 g/ml。
1.3统计学处理将所有数据都输入计算机，用SPSS for windows11.5版本软件进行单因素方差分析，计算结果以均数±标准差(±s)表示，检验水准α＝0.05。
Vs正常组**P<0.01，极显著性差异；Vs正常组*P<0.05，显著性差异。Vs损伤组##P<0.01，极显著性差异；Vs损伤组#P<0.05，显著性差异。
2心肌细胞鉴定结果
加药后，24 h内不同时间段于倒置显微镜下观察细胞，从细胞形态及搏动频率观察药物对细胞的作用。收集各组细胞并进行细胞计数和台盼蓝染色鉴定细胞存活率，根据细胞密度(×104个/ml)和细胞存活率分析赤芍总苷对心肌细胞的作用。
2.1心肌细胞形态变化
2.1.1正常组正常培养心肌细胞(图1)呈梭形或不规则三角形，核呈卵圆形并居中，搏动规律且有力，细胞搏动频率不一，频率为60～120次/min。
2.1.2损伤组损伤心肌细胞(图2～3)皱缩变圆，伪足减少，细胞搏动频率加快至100～200次/min，细胞搏动频率不一。
2.1.3TPG组TPG组心肌细胞(图4～6)的生长状态较好，细胞形态明显好于损伤组，且贴壁细胞多于损伤组；高剂量加药组的细胞生长状态及细胞存活率要好于低剂量的加药组，细胞的搏动频率明显慢于损伤组，搏动有力。随着赤芍总苷浓度的增大，细胞生长状态愈好，搏动频率愈慢，细胞搏动频率依次为120～180，110～160，80～120次/min。
2.1.4阳性对照组辅酶Q10组(图7)的贴壁细胞及生长状态好于损伤组，细胞的搏动频率较损伤组慢，细胞搏动频率不一，频率为80～130次/min。
图1正常对照组培养心肌细胞形态(略)
图2损伤组培养心肌细胞形态(略)
图3损伤组培养心肌细胞形态(略)
图4低剂量TPG组培养心肌细胞形态(略)
图5中剂量TPG组培养(略)
图6(略)
图7辅酶Q10阳性对照组培养心肌细胞形态(略)
2.2心肌细胞密度及存活率变化见表1。
表1心肌细胞密度及存活率变化(略)
由表1可见，正常对照组的细胞密度比较大，细胞存活率较高，达到95%±3%；异丙基肾上腺素导致的细胞损伤组，其细胞密度显著减少，细胞存活率仅有68%±5%；阳性对照组的细胞密度和细胞存活率较损伤组明显增大；赤芍总苷组细胞密度和存活率有显著增大的趋势，且随着赤芍总苷浓度的增大，细胞数量愈多，中、高剂量的赤芍总苷组细胞密度要大于阳性对照组。
2.3心肌细胞凋亡根据培养细胞DNA提取法[8]提取各组心肌细胞DNA，以λDNA(48 502 bp)为分子量标准，将各组DNA点样于1.0%琼脂糖凝胶，于75mA条件下电泳40 min。结果见图8～9。
图8心肌细胞DNA电泳图9心肌细胞DNA电泳(略)
图9(略)
3讨论
培养心肌细胞已成为一种广泛应用的实验技术，在心脏学研究领域中，可以建立许多心肌模型进行研究，实验证明这是从细胞和分子水平反映实验效果的一个很好的模型[9]。本实验用ISO造成培养乳鼠心肌细胞的缺血缺氧损伤模型，以CoQ10作为保护心肌细胞的阳性对照药物，旨在对比观察不同剂量TPG的保护作用。ISO可加快心率，使心肌耗氧量明显增加，造成心肌处于相对缺血缺氧状态[10]；而CoQ10具有稳定生物膜、抗氧化、清除自由基以及保护心肌的作用[11]。实验结果证实，ISO对培养60 h的乳鼠心肌细胞有明显的损伤作用；加入CoQ10的培养细胞形态学变化明显好于损伤组，培养液中心肌酶谱及抗氧化指标水平均比损伤组有显著降低，且DNA无凋亡现象，说明CoQ10对损伤的心肌细胞具有较好的保护作用。以上结果进一步证实培养乳鼠心肌细胞损伤缺血缺氧模型是一种较理想的离体研究心肌损伤的模型，可靠性、重复性较好，易于进行给药观察。
本实验采用生化实验法检测心肌细胞凋亡的状况。琼脂糖凝胶电泳结果显示，损伤组DNA降解为分子量较小的片段，呈现细胞凋亡所特有的“梯状带”；各TPG组和辅酶Q10阳性对照组呈现出类似正常对照组的单一条带，无凋亡现象。实验结果表明，ISO对心肌细胞凋亡有诱导作用，致使DNA链断裂；TPG可抑制细胞凋亡的出现。正常心肌细胞DNA的迁移距离与λDNA相接近，提示乳鼠心肌细胞DNA的分子大约为48 000 bp。
综上所述，TPG对ISO造成的培养乳鼠心肌细胞损伤具有保护作用，而且TPG的保护作用呈现剂量依赖关系，检测指标的改善与TPG的加药量有关，保护作用随着剂量增大而明显增强，高剂量TPG组的保护作用优于辅酶Q10组。作用机理与TPG改善心肌细胞的能量和物质代谢，从而提高心肌细胞的存活，保证心肌细胞的正常收缩功能，减轻细胞膜损伤程度，较好地控制了DNA链的断裂，降低细胞凋亡的出现有关。
参考文献：
[1]黄海霞，莫晓燕.中药对心肌细胞损伤的保护作用[J].中草药,2003，34(12)：11501152.
[2]单家银，屈松柏.中药对培养心肌细胞损伤保护作用的研究进展[J].湖北中医学院学报，2000，2(1)：5253.
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[4]赵明中,刘岚,汪家瑞,等.通心络胶囊对异丙肾上腺素致大鼠心肌损伤保护作用的实验研究[J].中国中西医结合杂志,2001,21(1):5153.
[5]王玉林,彭京洪,马沛然,等.中药芪芍五味合剂对病毒性心肌炎小鼠心肌细胞凋亡和坏死的影响[J].山东医药,2002, 42(22):1619.
[6]刘干中，王建华，周金黄.世纪之交:现代中医药药理学的回顾与展望[J].基础医学与临床,2000,2(5):385387.
[7]阮金兰,赵钟祥,曾庆忠，等.赤芍化学成分和药理作用的研究进展[J].中国药理学通报,2003,19(9): 965970.
[8]鄂征.组织培养和分子细胞学技术[M].北京：北京出版社,1995.271273.
[9]董丰,龚开政,张振刚.原代心肌细胞培养方法的探讨[J].大连医科大学学报, 2001,23(4):307308.
[10]徐晋,张杰武,马肃,等.异丙基肾上腺素导致大鼠心肌损伤的酶组织化学及超微结构观察[J].中国组织化学与细胞化学杂志,1995,4(3):301303.
[11] Mellors A, Tappel AL. The inhibition of mitochondrial peroxidation by ubiquinone and ubiquinol[J].J Biol Chem,1966,241:43534356.
(1.西安交通大学生命科学与技术学院，陕西 西安710049；2.西安交通大学医学院，陕西 西安710061), 百拇医药(黄海霞 莫晓燕 杜晓阳 张振强 耿涛)