氟西汀衍生物对映体在纤维素手性固定相上的拆分
第32 卷
2004 年10 月
分析化学(FENXI HUAXUE) 研究报告
Chinese Journal of Analytical Chemistry
第10 期
1353～1355
氟西汀衍生物对映体在纤维素手性固定相上的拆分
郭兴杰 许 勇 李发美
3
(沈阳药科大学药学院,沈阳110016)
摘 要 用纤维素2三(3 ,52二甲苯基氨基甲酸酯) (Chiralcel OD) 手性固定相拆分了两种氟西汀衍生物对映
体。使用15cm 长色谱柱分离NBD2氟西汀衍生物的流动相为四氢呋喃/ 正己烷(25∶75) ,分离DBD2氟西汀衍生
物的流动相为四氢呋喃/ 正己烷(20∶80) ;流速为1. 0 mL/ min ,荧光检测,柱温为室温。醇类改性剂作流动相甚
至不能部分拆分氟西汀衍生物。实验考察了四氢呋喃含量和柱长对手性分离的影响,探讨了手性拆分氟西汀
衍生物的机理。
关键词 氟西汀,Chiralcel OD ,手性固定相,对映体拆分
2003210217 收稿;2004206217 接受
1 引 言
氟西汀(Fluoxetine ,FLX) 为选择性52羟色胺重摄取抑制剂,主要用于抑郁症的治疗。临床上氟西
汀以消旋体给药,但R2和S2对映体的药理活性并不相同1 ～3 。许多文献报道了手性分离氟西汀的液
相色谱方法, 其中包括使用蛋白固定相或衍生化纤维素固定相4 、乙酰化环糊精固定相5 ,6 的直接拆
分法,也有先将氟西汀衍生化为非对映体,再用硅胶色谱柱分离的间接拆分法7 ,8 。
在乙腈中,氟西汀能和荧光衍生化试剂42(N2氯甲酰甲基2N2甲基) 胺基272硝基苯并22 21 ,32二唑
(NBD2COCl) 或42(N2氯甲酰甲基2N2甲基) 胺基272(N ,N2二甲胺磺酰基苯并22 21 ,32二唑(DBD2COCl)
反应,生成新的光学对映体(见图1) 。文献9 使用直链淀粉2三(3 ,52二甲苯基氨基甲酸酯) (ChiralPak
AD2RH) 手性固定相分离其衍生化产物。本实验使用另一种多糖类手性固定相———纤维素2三(3 ,52二
甲苯基氨基甲酸酯) (Chiralcel OD) 分离氟西汀的荧光衍生物,并对分离机理进行了探讨。
图1 氟西汀和NBD2COCl 或DBD2COCl 的衍生化反应
Fig. 1 Scheme of fluorescence derivatization of fluoxetine with NBD2 or DBD2COCl
2 实验部分
2. 1 仪器与试剂
Hitachi 高效液相色谱仪(日本日立公司) ,含L27300 泵、L27400 荧光检测器、Rheodyne7125 进样阀
和D27500 色谱积分仪。
氟西汀(FLX , 美国Tocris 公司) ;42(N2氯甲酰甲基2N2甲基) 胺基272硝基苯并22 21 ,32二唑(NBD2
COCl) 和42(N2氯甲酰甲基2N2甲基) 胺基272(N ,N2二甲胺磺酰基苯并22 21 ,32二唑(DBD2COCl) (日本
Kasei 公司) ;四氢呋喃( THF) 、正己烷和其它试剂均为色谱纯。氟西汀的NBD2和DBD2COCl 衍生物
(NBD2FLX、DBD2FLX) 的制备方法和文献9 相同。
2. 2 色谱条件
色谱柱为Chiralcel OD(250 mm ×4. 6 mm , 5μm ,150 mm ×4. 6 mm , 5μm) ,流动相为不同浓度的
四氢呋喃/ 正己烷,流速1. 0 min/ mL ,NBD2FLX 检测波长:λex = 478 nm ,λem = 537 nm ;DBD2FLX 检测
波长,λex = 454 nm ,λem = 562 nm ,室温操作,进样体积20μL 。
3 结果与讨论
3. 1 流动相中四氢呋喃含量对手性分离的影响
用四氢呋喃/ 正己烷作流动相,使用15 cm 长
的OD 柱,能较好地分离NBD2FLX 和DBD2FLX
(见表1) 。从表1 可见,四氢呋喃在流动相中比例
增加,引起容量因子( k′) 迅速下降、分离度( Rs) 变
小,但对分离因子(α) 影响较小。比较NBD2FLX
和DBD2FLX ,前者更易在OD 柱上获得保留,所以
α和Rs 值明显大于后者。
3. 2 OD 柱长度对分离的影响
同时实验了15 和25 cm 两种色谱柱,图2 和
图3 是使用不同长度的色谱柱拆分NBD2FLX
表1 流动相中四氢呋喃含量对拆分氟西汀衍生物的影响
Table 1 Influence of tetrahydrofurane ( THF) content in mo2
bile phase on the enantiomeric separations of NBD2fluoxetine
(FLX) and DBD2FLX
样品
Samples
THF
( %)
k′S k′R α RS
NBD2FLX
20
25
20. 68
8. 57
26. 20
10. 54
1. 27
1. 23
2. 64
1. 64
DBD2FLX
20
25
14. 37
5. 79
16. 82
6. 83
1. 17
1. 18
1. 36
1. 04
k′S 为S2对映体的容量因子( k′S was capacity factor of the S2
isomer) ; k′R 为R2对映体的容量因子( k′R was capacity factor of
the R2 isomer)
和DBD2FLX 的色谱图。从图中可见,和短柱相比,长柱虽然有较长的保留时间,但α和Rs 值改善不
大。
3. 3 分离机理的探讨
对于纤维素2三(3 ,52二甲苯基氨基甲酸酯) 固定相,厂家建议使用的流动相为正己烷和醇类有机改
性剂。而实验以甲醇、乙醇和异丙醇作改性剂,均不能完全甚至部分拆分两种氟西汀衍生物。众所周
知,由于氨基甲酸酯基团的存在,手性固定相和对映体、流动相之间都存在氢键作用力。按照Kirk2
land10 的观点,若氢键作用力为手性固定相和对映体之间的主要作用力,通过改变流动相的组成来减
弱固定相和流动相之间的氢键作用力可增加对映体拆分的机会。与小分子醇相比,大分子醇类如正丁
醇、叔丁醇等用作流动相,由于空间位阻作用可以减弱固定相和流动相之间的氢键作用力,但不能拆分
氟西汀衍生物对映体。于是实验了四氢呋喃、二氯甲烷、乙腈、乙酸乙酯及叔丁醚作有机改性剂。结果
表明,四氢呋喃/ 正己烷作流动相能基线分离两种衍生物,说明手性固定相和对映体之间的3 种作用力
4 5 3 1 分析化学第32 卷
———氢键作用力、偶极2偶极作用力和π2π作用力,以氢键作用力占主导作用。NBD2FLX 和DBD2FLX
在化学结构上仅仅7 位取代基不同,但前者的α和RS 值明显大于后者,类似的现象在前面的研究中已
经遇到9 ,可以解释为:由于7 位硝基的吸电子作用,NBD 衍生物是比DBD 衍生物更强的π电子接受
体,较容易和具有π电子给予体的手性固定相发生π2π作用。
3. 4 对映体的洗脱顺序
用四氢呋喃/ 正己烷作流动相在OD 色谱柱上分离氟西汀衍生物对映体时, S2对映体先被洗脱。由
于得不到R2和S2氟西汀对照品,故参阅文献4 方法,用OD 色谱柱,异丙醇/ 正己烷(1. 5∶98. 5) ,0. 2 %
二乙胺作流动相,制备了氟西汀对映体( S2对映体先出柱) 。经衍生化,用保留时间定性了氟西汀衍生
物对映体的洗脱顺序。在OD 固定相上氟西汀衍生物对映体的洗脱顺序和在AD2RH 固定相9 的洗脱
顺序相同。
3. 5 色谱柱的稳定性
在上述条件下操作,未发现柱效降低、损坏等异常现象。Kirkland10 实验了50 %甲基叔丁基醚、30 %四氢呋喃、10 %二氯甲烷及10 %乙酸乙酯等溶剂作流动相改性剂,证明OD 固定相在这些流动相
中非常稳定。
References
1 Wong D T , Bymaster F P , Engleman E A. L if e Sci . , 1995 , 57 : 411～441
2 Fuller R W , Wong D T , Robertson D W. Med. Res . Rev , 1991 , 11 (1) : 17～34
3 Schmider J , Greenblatt D J , Van Moltke L L , Karsov D , Shader R I. B r. J . Clin. Pharmacol . , 1997 , 44 (5) : 495～
498
4 Olsen B A , Wirth D D , Larew J S. J . Pharm. Biomed. A nal . , 1998 , 17 : 623～630
5 Piperaki S , Parissi2Poulou M. Chi rality , 1993 , 5 : 258～266
6 Piperaki S , Tsantili2Kakaulidou A , Parissi2Poulou M. Chi rality , 1995 , 7 : 257～266
7 Peyton A L , Carpenter R , Rutkowski K. Pharm. Res , 1991 , 8 : 1528～1532
8 Potts B D , Parli C J . J . L iq. Chromatogr. , 1992 , 15 : 665～681
9 Guo X , Fukushima T , Li F , Imai K. A nalyst , 2002 , 127 : 480～484
10 Kirkland K M. J . Chromatogr. A , 1995 , 718 : 9～26
Enantiomeric Separation of Derivatized
Fluoxetine on Chiralcel OD Column
Guo Xingjie , Xu Yong , Li Famei
3
( S henyang Pharmaceutical University , S henyang 110016)
Abstract The derivatized fluoxetine with 42(N2chloroformylmethyl2 N2methyl) amino272nit ro22 ,1 ,32ben2
zoxadiazole (NBD2COCl) or 42(N2chloroformethyl2N2methyl) amino272N ,N2Dimethylamino2sulfonyl22 ,1 ,32benzoxadiazole (DBD2COCl ) was enantiomerically separated on cellulosed2based chiral stationary phase
(Chiralcel OD) in the normal mode. For NBD2FLX , The better mobile phases used were tet rahydrofuran/
hexane (25∶75) on 15 cm OD column and for DBD2FLX , tet rahydrofuran/ hexane (20∶80) ,at a flow rate of
110 mL/ min. The fluorescence detection was used. When alcohol modifiers such as methanol , ethanol ,isopropanol , 12butanol or tert2butanol were employed , no separation was observed. Effect s of tet rahydrofu2
ran content and column length on the separation were examined. Also , the separation mechanism of two
derivatives on OD column was discussed.
Keywords Fluoxetine , chiralcel OD ,chiral stationary phase ,enantiomeric separation
(Received 17 October 2003 ; accepted 17 J une 2004)
5 5 3 1 第10 期郭兴杰等:氟西汀衍生物对映体在纤维素手性固定相上的拆分, 百拇医药
2004 年10 月
分析化学(FENXI HUAXUE) 研究报告
Chinese Journal of Analytical Chemistry
第10 期
1353～1355
氟西汀衍生物对映体在纤维素手性固定相上的拆分
郭兴杰 许 勇 李发美
3
(沈阳药科大学药学院,沈阳110016)
摘 要 用纤维素2三(3 ,52二甲苯基氨基甲酸酯) (Chiralcel OD) 手性固定相拆分了两种氟西汀衍生物对映
体。使用15cm 长色谱柱分离NBD2氟西汀衍生物的流动相为四氢呋喃/ 正己烷(25∶75) ,分离DBD2氟西汀衍生
物的流动相为四氢呋喃/ 正己烷(20∶80) ;流速为1. 0 mL/ min ,荧光检测,柱温为室温。醇类改性剂作流动相甚
至不能部分拆分氟西汀衍生物。实验考察了四氢呋喃含量和柱长对手性分离的影响,探讨了手性拆分氟西汀
衍生物的机理。
关键词 氟西汀,Chiralcel OD ,手性固定相,对映体拆分
2003210217 收稿;2004206217 接受
1 引 言
氟西汀(Fluoxetine ,FLX) 为选择性52羟色胺重摄取抑制剂,主要用于抑郁症的治疗。临床上氟西
汀以消旋体给药,但R2和S2对映体的药理活性并不相同1 ～3 。许多文献报道了手性分离氟西汀的液
相色谱方法, 其中包括使用蛋白固定相或衍生化纤维素固定相4 、乙酰化环糊精固定相5 ,6 的直接拆
分法,也有先将氟西汀衍生化为非对映体,再用硅胶色谱柱分离的间接拆分法7 ,8 。
在乙腈中,氟西汀能和荧光衍生化试剂42(N2氯甲酰甲基2N2甲基) 胺基272硝基苯并22 21 ,32二唑
(NBD2COCl) 或42(N2氯甲酰甲基2N2甲基) 胺基272(N ,N2二甲胺磺酰基苯并22 21 ,32二唑(DBD2COCl)
反应,生成新的光学对映体(见图1) 。文献9 使用直链淀粉2三(3 ,52二甲苯基氨基甲酸酯) (ChiralPak
AD2RH) 手性固定相分离其衍生化产物。本实验使用另一种多糖类手性固定相———纤维素2三(3 ,52二
甲苯基氨基甲酸酯) (Chiralcel OD) 分离氟西汀的荧光衍生物,并对分离机理进行了探讨。
图1 氟西汀和NBD2COCl 或DBD2COCl 的衍生化反应
Fig. 1 Scheme of fluorescence derivatization of fluoxetine with NBD2 or DBD2COCl
2 实验部分
2. 1 仪器与试剂
Hitachi 高效液相色谱仪(日本日立公司) ,含L27300 泵、L27400 荧光检测器、Rheodyne7125 进样阀
和D27500 色谱积分仪。
氟西汀(FLX , 美国Tocris 公司) ;42(N2氯甲酰甲基2N2甲基) 胺基272硝基苯并22 21 ,32二唑(NBD2
COCl) 和42(N2氯甲酰甲基2N2甲基) 胺基272(N ,N2二甲胺磺酰基苯并22 21 ,32二唑(DBD2COCl) (日本
Kasei 公司) ;四氢呋喃( THF) 、正己烷和其它试剂均为色谱纯。氟西汀的NBD2和DBD2COCl 衍生物
(NBD2FLX、DBD2FLX) 的制备方法和文献9 相同。
2. 2 色谱条件
色谱柱为Chiralcel OD(250 mm ×4. 6 mm , 5μm ,150 mm ×4. 6 mm , 5μm) ,流动相为不同浓度的
四氢呋喃/ 正己烷,流速1. 0 min/ mL ,NBD2FLX 检测波长:λex = 478 nm ,λem = 537 nm ;DBD2FLX 检测
波长,λex = 454 nm ,λem = 562 nm ,室温操作,进样体积20μL 。
3 结果与讨论
3. 1 流动相中四氢呋喃含量对手性分离的影响
用四氢呋喃/ 正己烷作流动相,使用15 cm 长
的OD 柱,能较好地分离NBD2FLX 和DBD2FLX
(见表1) 。从表1 可见,四氢呋喃在流动相中比例
增加,引起容量因子( k′) 迅速下降、分离度( Rs) 变
小,但对分离因子(α) 影响较小。比较NBD2FLX
和DBD2FLX ,前者更易在OD 柱上获得保留,所以
α和Rs 值明显大于后者。
3. 2 OD 柱长度对分离的影响
同时实验了15 和25 cm 两种色谱柱,图2 和
图3 是使用不同长度的色谱柱拆分NBD2FLX
表1 流动相中四氢呋喃含量对拆分氟西汀衍生物的影响
Table 1 Influence of tetrahydrofurane ( THF) content in mo2
bile phase on the enantiomeric separations of NBD2fluoxetine
(FLX) and DBD2FLX
样品
Samples
THF
( %)
k′S k′R α RS
NBD2FLX
20
25
20. 68
8. 57
26. 20
10. 54
1. 27
1. 23
2. 64
1. 64
DBD2FLX
20
25
14. 37
5. 79
16. 82
6. 83
1. 17
1. 18
1. 36
1. 04
k′S 为S2对映体的容量因子( k′S was capacity factor of the S2
isomer) ; k′R 为R2对映体的容量因子( k′R was capacity factor of
the R2 isomer)
和DBD2FLX 的色谱图。从图中可见,和短柱相比,长柱虽然有较长的保留时间,但α和Rs 值改善不
大。
3. 3 分离机理的探讨
对于纤维素2三(3 ,52二甲苯基氨基甲酸酯) 固定相,厂家建议使用的流动相为正己烷和醇类有机改
性剂。而实验以甲醇、乙醇和异丙醇作改性剂,均不能完全甚至部分拆分两种氟西汀衍生物。众所周
知,由于氨基甲酸酯基团的存在,手性固定相和对映体、流动相之间都存在氢键作用力。按照Kirk2
land10 的观点,若氢键作用力为手性固定相和对映体之间的主要作用力,通过改变流动相的组成来减
弱固定相和流动相之间的氢键作用力可增加对映体拆分的机会。与小分子醇相比,大分子醇类如正丁
醇、叔丁醇等用作流动相,由于空间位阻作用可以减弱固定相和流动相之间的氢键作用力,但不能拆分
氟西汀衍生物对映体。于是实验了四氢呋喃、二氯甲烷、乙腈、乙酸乙酯及叔丁醚作有机改性剂。结果
表明,四氢呋喃/ 正己烷作流动相能基线分离两种衍生物,说明手性固定相和对映体之间的3 种作用力
4 5 3 1 分析化学第32 卷
———氢键作用力、偶极2偶极作用力和π2π作用力,以氢键作用力占主导作用。NBD2FLX 和DBD2FLX
在化学结构上仅仅7 位取代基不同,但前者的α和RS 值明显大于后者,类似的现象在前面的研究中已
经遇到9 ,可以解释为:由于7 位硝基的吸电子作用,NBD 衍生物是比DBD 衍生物更强的π电子接受
体,较容易和具有π电子给予体的手性固定相发生π2π作用。
3. 4 对映体的洗脱顺序
用四氢呋喃/ 正己烷作流动相在OD 色谱柱上分离氟西汀衍生物对映体时, S2对映体先被洗脱。由
于得不到R2和S2氟西汀对照品,故参阅文献4 方法,用OD 色谱柱,异丙醇/ 正己烷(1. 5∶98. 5) ,0. 2 %
二乙胺作流动相,制备了氟西汀对映体( S2对映体先出柱) 。经衍生化,用保留时间定性了氟西汀衍生
物对映体的洗脱顺序。在OD 固定相上氟西汀衍生物对映体的洗脱顺序和在AD2RH 固定相9 的洗脱
顺序相同。
3. 5 色谱柱的稳定性
在上述条件下操作,未发现柱效降低、损坏等异常现象。Kirkland10 实验了50 %甲基叔丁基醚、30 %四氢呋喃、10 %二氯甲烷及10 %乙酸乙酯等溶剂作流动相改性剂,证明OD 固定相在这些流动相
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References
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6 Piperaki S , Tsantili2Kakaulidou A , Parissi2Poulou M. Chi rality , 1995 , 7 : 257～266
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10 Kirkland K M. J . Chromatogr. A , 1995 , 718 : 9～26
Enantiomeric Separation of Derivatized
Fluoxetine on Chiralcel OD Column
Guo Xingjie , Xu Yong , Li Famei
3
( S henyang Pharmaceutical University , S henyang 110016)
Abstract The derivatized fluoxetine with 42(N2chloroformylmethyl2 N2methyl) amino272nit ro22 ,1 ,32ben2
zoxadiazole (NBD2COCl) or 42(N2chloroformethyl2N2methyl) amino272N ,N2Dimethylamino2sulfonyl22 ,1 ,32benzoxadiazole (DBD2COCl ) was enantiomerically separated on cellulosed2based chiral stationary phase
(Chiralcel OD) in the normal mode. For NBD2FLX , The better mobile phases used were tet rahydrofuran/
hexane (25∶75) on 15 cm OD column and for DBD2FLX , tet rahydrofuran/ hexane (20∶80) ,at a flow rate of
110 mL/ min. The fluorescence detection was used. When alcohol modifiers such as methanol , ethanol ,isopropanol , 12butanol or tert2butanol were employed , no separation was observed. Effect s of tet rahydrofu2
ran content and column length on the separation were examined. Also , the separation mechanism of two
derivatives on OD column was discussed.
Keywords Fluoxetine , chiralcel OD ,chiral stationary phase ,enantiomeric separation
(Received 17 October 2003 ; accepted 17 J une 2004)
5 5 3 1 第10 期郭兴杰等:氟西汀衍生物对映体在纤维素手性固定相上的拆分, 百拇医药