举步跨越待有时——专家谈造血干细胞基因治疗的难点和重点
在前不久举办的“第一届全国干细胞移植在心血管疾病中的应用研讨会”及“第十六届长城心血管病会议”上，与会人员对“造血干细胞能不能做基因治疗的载体”这个议题存在着分歧，展开了辩论。日前，记者就造血干细胞基因治疗的一些热点问题采访了我国实验血液学会的创始人之一、著名血液病学家——军事医学科学院基础医学研究所的唐佩弦教授。
■造血干细胞是基因治疗理想的载体细胞
唐佩弦教授明确表示，造血干细胞是目前基因治疗理想的载体细胞。
他解释说，国际上临床进行基因治疗是从1991年开始的，至今有关的基础研究已取得了很大进展，但一些重大难题仍未解决。例如：基因转染的载体、目的基因体内转染的靶向性、目的基因在体内表达的水平和时间的调控以及有治疗效果基因的选择和寻找等等。美国几例腺苷脱氨酶(ADA)基因治疗病例都表明，其带有目的基因的细胞在病人体内维持时间太短。为了使目的基因能在病人体内长期或永恒的表达，必须选一种能在体内自我更新、自我维持的永不消亡的细胞作为目的基因的宿主细胞，于是，造血干细胞便成为目前最理想的目的基因转染的靶细胞。
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1993年前，人们已在小鼠中成功地把目的基因转染整合到小鼠骨髓细胞的染色体基因组中，使目的基因在小鼠体内持续表达。这些实验小鼠一年以后30%的外周血细胞仍带有目的基因及其前病毒载体。这时，人们以为，基因转染人的造血干细胞也同样容易实现，于是美国各大药厂纷纷大量投资进行基因治疗的临床前研究和临床试验。由于当时基因治疗的基础研究水平还不是很高，人们对造血干细胞生物学、分子病毒学及载体构建技术的知识不足，所以到1995年，所有相关临床试验几乎都以失败告终。之后，科研人员总结教训，对造血干细胞生物学和病毒载体的筛选、重组及其转染技术等又进行了广泛深入的研究。这些年虽有不少可喜的进展，但一些难点至今仍未有突破。
■造血干细胞做基因载体屡遭失败的两大原因
基因转染率太低既然造血干细胞是基因治疗理想的载体细胞，那为什么目前用人造血干细胞做基因载体的研究屡遭失败呢?
唐佩弦教授指出，这主要是因为，在人造血干细胞做基因载体的研究中，一个重要步骤是用人造血干细胞做基因转染，而其中一个关键困难是基因转染率太低。考虑到由于正常干细胞数量太少，而病毒颗粒在体外生物半衰期很短(6～8小时)，其布朗运动极慢(600微米/小时)，导致病毒颗粒在培养液中与靶细胞相遇的几率很低，于是许多人热衷于体外扩增干细胞，但至今未见有成功的报告。其原因有三：首先，干细胞的基本特征是自我维持和自我更新，即干细胞通过不对称性的有丝分裂，在不断产生祖细胞的同时，使自己不增殖也不分化。最近国外学者报告，在体外培养中证实了干细胞的上述特征，证明正常造血干细胞是不能扩增的。CD34细胞群体良性生长的比例结构应该是尖向上的正向三角形，即越是早期的细胞越少。干细胞是CD34细胞群体最小的一部分。CD34/38-/Lin-为干细胞，CD34/38/Lin为祖细胞，不可把CD34细胞笼统地称为干细胞。有研究者希望正常干细胞在培养中既大量增殖，又不分化，这实际上意味着细胞的恶性生长。
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其次，目前的研究水平还缺乏一种模拟体内造血微环境的培养体系。在体外培养CD34细胞时，加入的细胞因子，有的既能促进细胞增殖，又能促进细胞分化，例如白介素3等。这些细胞因子加在CD34细胞的培养液中，使祖细胞大量扩增，同时也促使干细胞的分化。当祖细胞扩增数量达到最高峰时，也可能是干细胞分化耗尽之际。干细胞在体内微环境下的有丝分裂中，其中一个子细胞保持不分化；但在体外培养中，干细胞就失去这种自我维持的能力，不久就分化消失了。
此外，迄今为止，造血干细胞还没有一个体外培养集落检测的方法。高增殖潜能集落形成单位(CFU-HPP)、长期培养启动细胞(LTC-IC)等也是最早期的髓系造血祖细胞，它们和干细胞移植后的造血永久重建无相关性。许多临床细胞移植的病例报告表明，经体外扩增后的移植物中虽然含有大量CFU-HPP或LTC-IC，但移植后病人体内的外源性造血重建都仅仅维持不足6个月。国内外不少进行CD34体外细胞扩增的研究，只看CD34细胞的计数和祖细胞集落观察指标，都缺乏检测干细胞的手段。
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小鼠基因转染不适用于人能成功地用于小鼠造血干细胞的基因转染技术却不适用于人，是制约造血干细胞的基因治疗成功的第二大瓶颈。
唐佩弦教授表示，逆转录病毒颗粒进入靶细胞，首先必须是病毒颗粒的外壳糖蛋白gpTO和靶细胞表面某种蛋白专一性的结合。靶细胞表面专一性结合某种病毒的蛋白，称为病毒受体。用于小鼠的亲嗜性逆转录病毒载体只能用于小鼠，而不能用于人。小鼠造血干细胞表面有较丰富的亲嗜性逆转录病毒受体，而人的造血干细胞表面则没有，仅有少量的双嗜性逆转录病毒受体(即PIT-2受体)。所以，适用于人造血干细胞做基因转染的，是重组的双嗜性逆转录病毒载体。科学家们目前正致力于如何增加人干细胞表达专一性的PIT-2受体，以增加基因的转染率。
■干细胞基因治疗的前途展望
既然有两个瓶颈尚未克服，那么如何看待干细胞基因治疗的未来呢？唐佩弦教授表示，前景还是乐观的，但首先要搞清的问题就是造血干细胞的基因转染率是否一定需要很高，即干细胞移植成功究竟至少需要多少干细胞植入骨髓。造血干细胞临床移植成功后，有的学者提出了一种学说，从理论上估计有几千或甚至几百个干细胞植入骨髓就够了。也就是说，如果设法把带有目的基因的CD34细胞直接输入骨髓腔，则即使细胞的基因转染率低，也照样可以达到基因治疗的目的，但目前还没有获得实验佐证。他认为，在不久的将来，随着人类基因组研究和造血干细胞生物学的发展，将可能找出干细胞调控分化的基因，干细胞分化调控机制和自我维持、自我更新的调控机理也将得到充分阐明。若能在体外有效制备出正常人类造血干细胞的细胞株而不发生恶变，造血干细胞的移植和基因治疗在技术上将毫无困难。
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谈到国内的相关研究时，唐佩弦教授强调，国内科研人员经常用干细胞进行目的基因的短期表达，这实际上是认识上存在的一个误区。他解释说，如果不是为了弥补基因缺陷，而是为了在短时间内达到某个治疗目的，仅要求目的基因在病人体内短期表达。但当基因治疗某些疾病，尤其是要求目的基因能在体内永恒表达以发挥治疗作用的疾病，例如糖尿病、高血压、帕金森病、先天性单基因缺损的各种疾患等，其目的基因的理想宿主细胞自然是可不断分化的干细胞。
他指出，人类造血干细胞基因治疗实际上是基因治疗技术和造血干细胞移植技术的融合和发展，也是学科交叉的产物。它不但促进干细胞生物学的发展，为基因治疗开辟了新的领域，而且也将扩大造血干细胞移植的适应证范围，使整个血液学发展到一个新纪元。
本报记者 应洪舒, http://www.100md.com
■造血干细胞是基因治疗理想的载体细胞
唐佩弦教授明确表示，造血干细胞是目前基因治疗理想的载体细胞。
他解释说，国际上临床进行基因治疗是从1991年开始的，至今有关的基础研究已取得了很大进展，但一些重大难题仍未解决。例如：基因转染的载体、目的基因体内转染的靶向性、目的基因在体内表达的水平和时间的调控以及有治疗效果基因的选择和寻找等等。美国几例腺苷脱氨酶(ADA)基因治疗病例都表明，其带有目的基因的细胞在病人体内维持时间太短。为了使目的基因能在病人体内长期或永恒的表达，必须选一种能在体内自我更新、自我维持的永不消亡的细胞作为目的基因的宿主细胞，于是，造血干细胞便成为目前最理想的目的基因转染的靶细胞。
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1993年前，人们已在小鼠中成功地把目的基因转染整合到小鼠骨髓细胞的染色体基因组中，使目的基因在小鼠体内持续表达。这些实验小鼠一年以后30%的外周血细胞仍带有目的基因及其前病毒载体。这时，人们以为，基因转染人的造血干细胞也同样容易实现，于是美国各大药厂纷纷大量投资进行基因治疗的临床前研究和临床试验。由于当时基因治疗的基础研究水平还不是很高，人们对造血干细胞生物学、分子病毒学及载体构建技术的知识不足，所以到1995年，所有相关临床试验几乎都以失败告终。之后，科研人员总结教训，对造血干细胞生物学和病毒载体的筛选、重组及其转染技术等又进行了广泛深入的研究。这些年虽有不少可喜的进展，但一些难点至今仍未有突破。
■造血干细胞做基因载体屡遭失败的两大原因
基因转染率太低既然造血干细胞是基因治疗理想的载体细胞，那为什么目前用人造血干细胞做基因载体的研究屡遭失败呢?
唐佩弦教授指出，这主要是因为，在人造血干细胞做基因载体的研究中，一个重要步骤是用人造血干细胞做基因转染，而其中一个关键困难是基因转染率太低。考虑到由于正常干细胞数量太少，而病毒颗粒在体外生物半衰期很短(6～8小时)，其布朗运动极慢(600微米/小时)，导致病毒颗粒在培养液中与靶细胞相遇的几率很低，于是许多人热衷于体外扩增干细胞，但至今未见有成功的报告。其原因有三：首先，干细胞的基本特征是自我维持和自我更新，即干细胞通过不对称性的有丝分裂，在不断产生祖细胞的同时，使自己不增殖也不分化。最近国外学者报告，在体外培养中证实了干细胞的上述特征，证明正常造血干细胞是不能扩增的。CD34细胞群体良性生长的比例结构应该是尖向上的正向三角形，即越是早期的细胞越少。干细胞是CD34细胞群体最小的一部分。CD34/38-/Lin-为干细胞，CD34/38/Lin为祖细胞，不可把CD34细胞笼统地称为干细胞。有研究者希望正常干细胞在培养中既大量增殖，又不分化，这实际上意味着细胞的恶性生长。
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其次，目前的研究水平还缺乏一种模拟体内造血微环境的培养体系。在体外培养CD34细胞时，加入的细胞因子，有的既能促进细胞增殖，又能促进细胞分化，例如白介素3等。这些细胞因子加在CD34细胞的培养液中，使祖细胞大量扩增，同时也促使干细胞的分化。当祖细胞扩增数量达到最高峰时，也可能是干细胞分化耗尽之际。干细胞在体内微环境下的有丝分裂中，其中一个子细胞保持不分化；但在体外培养中，干细胞就失去这种自我维持的能力，不久就分化消失了。
此外，迄今为止，造血干细胞还没有一个体外培养集落检测的方法。高增殖潜能集落形成单位(CFU-HPP)、长期培养启动细胞(LTC-IC)等也是最早期的髓系造血祖细胞，它们和干细胞移植后的造血永久重建无相关性。许多临床细胞移植的病例报告表明，经体外扩增后的移植物中虽然含有大量CFU-HPP或LTC-IC，但移植后病人体内的外源性造血重建都仅仅维持不足6个月。国内外不少进行CD34体外细胞扩增的研究，只看CD34细胞的计数和祖细胞集落观察指标，都缺乏检测干细胞的手段。
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小鼠基因转染不适用于人能成功地用于小鼠造血干细胞的基因转染技术却不适用于人，是制约造血干细胞的基因治疗成功的第二大瓶颈。
唐佩弦教授表示，逆转录病毒颗粒进入靶细胞，首先必须是病毒颗粒的外壳糖蛋白gpTO和靶细胞表面某种蛋白专一性的结合。靶细胞表面专一性结合某种病毒的蛋白，称为病毒受体。用于小鼠的亲嗜性逆转录病毒载体只能用于小鼠，而不能用于人。小鼠造血干细胞表面有较丰富的亲嗜性逆转录病毒受体，而人的造血干细胞表面则没有，仅有少量的双嗜性逆转录病毒受体(即PIT-2受体)。所以，适用于人造血干细胞做基因转染的，是重组的双嗜性逆转录病毒载体。科学家们目前正致力于如何增加人干细胞表达专一性的PIT-2受体，以增加基因的转染率。
■干细胞基因治疗的前途展望
既然有两个瓶颈尚未克服，那么如何看待干细胞基因治疗的未来呢？唐佩弦教授表示，前景还是乐观的，但首先要搞清的问题就是造血干细胞的基因转染率是否一定需要很高，即干细胞移植成功究竟至少需要多少干细胞植入骨髓。造血干细胞临床移植成功后，有的学者提出了一种学说，从理论上估计有几千或甚至几百个干细胞植入骨髓就够了。也就是说，如果设法把带有目的基因的CD34细胞直接输入骨髓腔，则即使细胞的基因转染率低，也照样可以达到基因治疗的目的，但目前还没有获得实验佐证。他认为，在不久的将来，随着人类基因组研究和造血干细胞生物学的发展，将可能找出干细胞调控分化的基因，干细胞分化调控机制和自我维持、自我更新的调控机理也将得到充分阐明。若能在体外有效制备出正常人类造血干细胞的细胞株而不发生恶变，造血干细胞的移植和基因治疗在技术上将毫无困难。
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谈到国内的相关研究时，唐佩弦教授强调，国内科研人员经常用干细胞进行目的基因的短期表达，这实际上是认识上存在的一个误区。他解释说，如果不是为了弥补基因缺陷，而是为了在短时间内达到某个治疗目的，仅要求目的基因在病人体内短期表达。但当基因治疗某些疾病，尤其是要求目的基因能在体内永恒表达以发挥治疗作用的疾病，例如糖尿病、高血压、帕金森病、先天性单基因缺损的各种疾患等，其目的基因的理想宿主细胞自然是可不断分化的干细胞。
他指出，人类造血干细胞基因治疗实际上是基因治疗技术和造血干细胞移植技术的融合和发展，也是学科交叉的产物。它不但促进干细胞生物学的发展，为基因治疗开辟了新的领域，而且也将扩大造血干细胞移植的适应证范围，使整个血液学发展到一个新纪元。
本报记者 应洪舒, http://www.100md.com